非酒精性脂肪性肝病不同發(fā)展階段的轉(zhuǎn)錄和代謝組學(xué)以及線粒體功能障礙的研究.pdf

1、背景和目的
　　非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種包括單純性非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化甚至肝癌等整個(gè)疾病譜的慢性肝臟疾病。NAFL具有進(jìn)展為NASH或引起2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitu

2、s，T2DM）的風(fēng)險(xiǎn)，但是臨床上NAFLD在肝內(nèi)和肝外方向的進(jìn)展并不完全同步。另外，目前也沒(méi)有確定的可用于NASH的無(wú)創(chuàng)性診斷標(biāo)記物。本課題的目的是研究NAFLD往肝臟或代謝不同方向進(jìn)展的影響因素和可能機(jī)制，并探索相應(yīng)生物標(biāo)記物及其用于NASH無(wú)創(chuàng)性診斷的潛在價(jià)值。
　　方法
　　通過(guò)建立NAFL、NASH和NAFL伴隨T2DM的大鼠模型來(lái)模擬NAFLD的不同發(fā)展階段。使用肝臟組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（大鼠表達(dá)譜芯片技術(shù)）和肝臟組織

3、及血清的代謝組學(xué)分析（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）來(lái)確定這些大鼠模型的基因表達(dá)譜和代謝譜特征。根據(jù)樣本基因探針兩兩比較的log2值和P值（|log2(ratio)|≥1且P<0.05）篩選差異表達(dá)的基因，從其中篩選在NAFLD不同發(fā)展階段表達(dá)趨勢(shì)有差異的因子，使用RT-PCR、western-blot和elisa驗(yàn)證其在肝臟和血清的基因和蛋白表達(dá)水平。根據(jù)正交偏最小二乘（OPLS）分析的變量投影重要性（VIP）值和P值（VIP>1且P<0.05

4、）篩選肝臟和血清的差異性表達(dá)代謝物。通過(guò)篩選NAFLD不同發(fā)展階段改變趨勢(shì)相同的基因和代謝物建立一個(gè)功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型。為探索線粒體功能障礙在NAFLD不同發(fā)展階段的表現(xiàn)，我們從大鼠肝臟中提取線粒體，檢測(cè)線粒體的膜電位（membrane potential，MP）、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶（carnit

5、ine palmitoyl transterase-1，CPT-1）的活性。
　　結(jié)果
　　1.我們發(fā)現(xiàn)4個(gè)可鑒別NAFL向 NASH或 T2DM方向進(jìn)展的因子，包括S100A9，SREBF1，TBX21和GIMAP4。其中，只有S100A9的基因和蛋白水平不僅在NAFL組的表達(dá)高于對(duì)照組，且與NAFL組相比時(shí)，在NASH組表達(dá)升高而在NAFL+T2DM組表達(dá)降低（P<0.05）。大鼠血清S100A9水平和NAFLD活動(dòng)性評(píng)

6、分（NAFLD Activity Score，NAS）、肝臟脂肪變?cè)u(píng)分、小葉炎癥評(píng)分、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素顯著正相關(guān)（P<0.001），而與空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)、甘油三酯和總膽固醇等代謝性指標(biāo)的相關(guān)性較弱（P<0.05）。S100A9用于NASH診斷的受試者工作特征曲線下面積（AUROC）為0.947（95％CI：0.845-1.049）。
　　2.與NAFL組相比，血清中的N-硬脂酰酪氨酸以及肝臟中的鳥(niǎo)氨酸水平在

7、NASH組升高，而在NAFL+T2DM組降低（P<0.05）；而肝臟中的S-腺苷高半胱氨酸、膽堿磷酸和肌酐在NASH組含量降低，而在NAFL+T2DM組含量升高（P<0.05）。同時(shí)與對(duì)照組相比，鳥(niǎo)氨酸在NAFL組水平也降低（P<0.05）。另外，大鼠肝臟和血清的硬脂酰肉毒堿在NAFL組、NASH組和NAFL+T2DM組都穩(wěn)定升高（P<0.05）。
　　3.功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模型顯示，在NAFL、NASH和NAFL+T2DM組共同發(fā)生的

8、改變有： Ccl2和Jun是中心調(diào)控因子；TNF、P53、NF-κB、PPAR、TLR和趨化因子信號(hào)通路發(fā)生上調(diào)；不飽和脂肪酸的合成、線粒體長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化、脂肪酸降解、肉毒堿/?；鈮A的轉(zhuǎn)換、膽汁分泌功能、谷胱甘肽代謝、花生四烯酸代謝和自噬功能等代謝通路發(fā)生改變。
　　4.線粒體中COX和CPT-1的活性隨著NAFLD的進(jìn)展逐漸降低。在NAFLD的不同階段都存在ROS水平升高和線粒體MP降低（P<0.05）。與NAFL組相比，N

9、ASH和NAFL+T2DM的ROS含量升高（P<0.05），但只有NASH組的線粒體MP降低（P<0.05），而NAFL+T2DM的線粒體MP與NAFL無(wú)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論
　　血清S100A9和肝臟鳥(niǎo)氨酸含量不僅具有預(yù)測(cè)NAFL發(fā)生的潛在價(jià)值，也可以預(yù)測(cè)NAFLD往肝臟或代謝不同方向的進(jìn)展。同時(shí)，血清S100A9是一個(gè)可用于NASH無(wú)創(chuàng)性診斷的潛在標(biāo)記物。在NAFLD的不同發(fā)展階段都存在線粒體功能障礙，且線粒