起博電流及HCN通道在心房顫動的機制研究及伊伐布雷定對心房顫動的干預研究.pdf

1、第一部分、轉基因心房顫動小鼠和野生型小鼠心房肌細胞的電生理學比較
　　目的：心房顫動（房顫）是臨床上最常見的心律失常之一，其發(fā)病機制復雜多樣，目前尚無確定的闡明其病理生理機制，本研究采用自發(fā)性房顫轉基因小鼠模型，研究小鼠心房肌細胞相關離子通道電流的改變，為進一步闡明房顫的發(fā)病機制提供理論基礎。
　　方法：本研究實驗組為自發(fā)性房顫轉基因小鼠模型，對照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠;采用VisualSonics Vevo7

2、70高分辨率小動物超聲系統(tǒng)對小鼠行心臟超聲檢測;采用PCLAB-UE生物信號采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數據;采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來急性分離小鼠心房肌細胞;采用標準的全細胞膜片鉗技術記錄動作電位和離子通道電流（瞬時外向鉀電流Ito、內向整流鉀通道IK1和起搏電流If）。
　　結果：心臟超聲數據顯示，野生型小鼠和轉基因小鼠的心臟結構和功能未見統(tǒng)計學差異。體表心電圖數據顯示，相比于野生型小鼠，轉基因小鼠

3、基礎心率偏慢（轉基因小鼠:391±61次/分;野生型小鼠:436±50次/分，p=0.048），轉基因小鼠QT間期較野生型小鼠的偏長（42.3±8.6ms比34.2±8.6ms，p=0.02），但用心率校正后得到QTc，二者無統(tǒng)計學差異（34±6.8ms比29.1±7.1ms，p=0.076）。膜片鉗記錄結果顯示，轉基因小鼠和野生型小鼠的單個心房肌細胞動作電位AP近似于三角形，其復極較快，二者靜息電位未見明顯差異（轉基因小鼠:-67.9

4、±5.0mV;野生型小鼠-65.3±4.2mV，p=0.350），APD未見明顯差異（59.1±14.3ms比46.0±12ms，p=0.082），其中APD20（4.8±0.5ms比4.9±0.8ms，p=0.837）、APD50(7.3±4.6ms比9.6±4.5ms，p=0.370)、APD90（29.2±8.8ms比25.6±8.2ms，p=0.437）比較均未見統(tǒng)計學差異。
　　在離子通道電流方面:Ito電流，轉基因小鼠

5、的峰值較野生型小鼠的峰值稍低，從-30mV～+70mV二者電流密度均有統(tǒng)計學差異，在70mV的電流密度（野生型小鼠:12.2±0.6pA/pF;轉基因小鼠11.0±0.7pA/pF，p=0.036），但在通道動力學方面，即穩(wěn)態(tài)啟動曲線在二者并無差異;IK1電流，野生型小鼠和轉基因小鼠心房肌細胞的未見明顯差異;If電流，轉基因小鼠的電流峰值較野生型小鼠的電流幅度明顯增大，尾電流（-40mV引出）也明顯增大，從-70mV～-170mV二者電

6、流密度均有統(tǒng)計學差異，在-170mV的電流密度（野生型小鼠:-26.9±3.0pA/pF;轉基因小鼠:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），轉基因小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯右移，Boltzmann方程擬合得到半激活電壓(V1/2)和斜率因子k，野生型小鼠V1/2為-128.2±1.65mV，而轉基因小鼠為-109.45±1.35mV(p＜0.05)，野生型和轉基因小鼠的k分別為13.91±0.98mV和14.41±0.78mV(p

7、=0.58)。
　　結論：轉基因房顫小鼠和野生型小鼠相比，二者的心臟結構和功能無明顯差異;轉基因房顫小鼠比野生型小鼠的心率稍慢，相應的QT間期略長，但經心率校正后的QTc在二者間并無差異;轉基因房顫小鼠和野生型小鼠的心房肌細胞的電生理特性即動作電位的特點未發(fā)現(xiàn)明顯差異;離子通道電流方面，轉基因房顫小鼠心房肌細胞的It0電流較野生型小鼠的略減弱，但通道動力學方面并無差異;IK1電流在二者的心房肌細胞中無差異;轉基因房顫小鼠心房肌細胞

8、的If電流密度明顯大于野生型小鼠，且心房肌細胞的If電流更容易激活，提示起搏電流可能參與了房顫的某種發(fā)生機制。
　　第二部分、轉基因心房顫動小鼠和野生型小鼠心房肌電流改變的分子機制比較
　　目的：心房顫動（簡稱房顫）的電生理特性改變的基礎在于心房肌細胞的離子通道改變，離子通道蛋白是房顫的關鍵分子底物。本研究采用自發(fā)性房顫轉基因小鼠模型，研究小鼠心房肌組織相關離子通道表達的改變，為闡明房顫的發(fā)病機制提供理論基礎。
　　方

9、法：本研究實驗組為自發(fā)性房顫轉基因小鼠模型，對照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠;采用RT-PCR方法檢測小鼠心房肌組織HCN通道m(xù)RNA(HCN2和HCN4)改變情況;采用Western-Blot方法檢測小鼠心房肌組織HCN通道蛋白（HCN2和HCN4）及Kv4蛋白（Kv4.2和Kv4.3）的改變情況。
　　結果：轉基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2 mRNA相對表達(HCN2/GAPDH)明顯高于野生型小鼠（1.10±0.4

10、0，N=6比0.36±0.17，N=6，p＜0.01）;同樣，HCN4 mRNA的在轉基因小鼠的心房肌組織中表達顯著高于野生型小鼠（1.48±0.63，N=6比0.52±0.11，N=6，p＜0.01）;WB結果顯示HCN2蛋白在野生型小鼠和轉基因小鼠心房肌組織中差異不明顯，而HCN4蛋白在轉基因小鼠中表達明顯高于野生型普通小鼠，經過蛋白條帶灰度值分析，得出轉基因小鼠心房肌組織HCN2的相對表達量為0.034±0.010，野生型小鼠為0

11、.035±0.017(p=1.00); HCN4蛋白的相對表達量二者中有顯著統(tǒng)計學差異（0.088±0.054比0.014±0.009，p=0.029）。Kv4.2和Kv4.3在野生型小鼠的表達明顯高于轉基因小鼠，Kv4.2蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達明顯高于轉基因小鼠（0.68±0.26比0.27±0.22，N=6，p=0.015），同樣，Kv4.3蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達亦明顯高于轉基因小鼠(1.04±0.13比0.

12、23±0.08，N=6，p=0.002)。
　　結論：轉基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對表達顯著高于野生型小鼠;轉基因小鼠心房肌組織的HCN4蛋白水平相對表達顯著高于野生型小鼠;轉基因小鼠心房肌組織的Kv4.2和Kv4.3蛋白水平相對表達顯著低于野生型小鼠。
　　第三部分、伊伐布雷定對心房顫動的預防作用及對起搏電流和HCN通道的影響
　　目的：近年來的研究發(fā)現(xiàn)起搏電流參與了房顫的發(fā)生發(fā)展病理生理

13、機制，作為起搏電流的特異性阻滯劑一伊伐布雷定，目前被證實通過抑制起搏電流進而減少某些心律失常的發(fā)生，本研究擬探討伊伐布雷定在心房顫動的預防和治療方面的作用以及對起搏電流及HCN通道的影響，為房顫的發(fā)病機制和防治打下理論基礎。
　　方法：本研究將5-6月齡大小、尚未發(fā)生房顫的轉基因小鼠隨機分為用藥組（15只）和對照組（15只），同齡的野生型C57B1/6小鼠也隨機分為用藥組（15只）和對照組（15只）;將伊伐布雷定（7mg/kg/天

14、，加入飲用水）喂養(yǎng)用藥組小鼠，持續(xù)時間為4個月，平均每2周行心電監(jiān)測，觀察心率變化情況及房顫的發(fā)生情況。
　　本研究采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來急性分離小鼠心房肌細胞;采用VisualSonics Vevo770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)對小鼠行心臟超聲檢測;采用PCLAB-UE生物信號采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數據;采用標準的全細胞膜片鉗技術記錄動作電位和離子通道電流;本研究采用RT-PCR方法檢測小鼠心

15、房肌組織HCN通道改變情況;采用Western-Blot方法檢測小鼠心房肌組織HCN通道蛋白改變情況。
　　結果：經過4個月的伊伐布雷定治療后，轉基因用藥組小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生率對照組小鼠明顯降低（用藥組:41％比對照組:16.7％，p＜0.01），野生型小鼠未記錄到房顫發(fā)作。在體表心電數據方面，轉基因用藥組小鼠心率較對照組下降了約13％（用藥組:392±61;對照組:342±57次/分，p=0.042），對應的QT間期和心率校正

16、后的QT間期(QTc)均無統(tǒng)計學差異;野生型用藥組小鼠較對照組下降了約11％（用藥組436±51次/分比對照組:387±32次/分，p=0.044），其對應的QT間期有所延長，但QTc無明顯差異。在心臟超聲數據方面，轉基因用藥組小鼠左室收縮末期內徑較對照組小鼠有所縮短，射血分數和縮短分數均有增加;野生型小鼠用藥組和對照組數據未見明顯統(tǒng)計學差異。膜片鉗單細胞動作電位記錄方面，轉基因用藥組小鼠和對照組小鼠心房肌細胞靜息電位、APD20、AP

17、D50及APD90差異均無統(tǒng)計學意義;同樣，野生型用藥組小鼠和對照組小鼠心房肌細胞上述指標亦均無統(tǒng)計學差異。在起搏電流記錄方面，轉基因用藥組小鼠心房肌起搏電流引出率較對照組明顯減低（46.7％比75.4％，p＜0.01），野生型用藥組小鼠和對照組未見差異(43.3％比49.2％，p=0.78);轉基因小鼠用藥組和對照組起搏電流比較，用藥組小鼠的電流幅度較對照組小鼠的電流幅度明顯減弱，尾電流也明顯減小，用藥組小鼠的I-V曲線明顯上移，從-

18、80mV～-170mV二者電流密度均有統(tǒng)計學差異（在-170mV的電流密度，用藥組:-17.7±3.0pA/pF，對照組:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），用藥組小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯左移，二者的半激活電壓(V1/2)（用藥組:-124.4±3.25mV，對照組:-109.45±0.72mV，p＜0.001）和斜率因子k(22.58±2.75mV比14.40±0.78mV，p＜0.001)均有顯著統(tǒng)計學差異。分子生物學方面

19、，伊伐布雷定應用后使得轉基因用藥組小鼠心房肌HCN2 mRNA相對表達下降了50％(用藥組:0.55±0.34比對照組:1.10±0.40，p=0.029)，同樣HCN4mRNA相對表達量下降了約63.5％(0.54±0.41比1.48±0.63，p=0.012);在野生型小鼠中用藥組和對照組心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對表達量均未見明顯統(tǒng)計學差異。在應用伊伐布雷定口服治療4個月后，轉基因用藥組小鼠和野生型用藥組小鼠心房肌

20、組織HCN2(0.02±0.0078比0.0097±0.006)及HCN4蛋白相對表達量(0.18±0.10比0.22±0.15)差異亦未見統(tǒng)計學意義。
　　結論：長期伊伐布雷定治療能顯著降低尚未進展為房顫的轉基因房小鼠的房顫發(fā)生率，對房顫的發(fā)生有一定的預防作用;伊伐布雷定治療能逆轉轉基因房顫小鼠的心臟電生理改變，這主要是降低了起搏電流的“功能獲得”作用，進而減弱了其自發(fā)性電活動而起到抗心律失常作用;伊伐布雷定的抗心律失常作用不依