核基質(zhì)附著區(qū)MAR增強(qiáng)Survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因CD-TK靶向治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織(WHO)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(TheInternationalAgencyforResearchonCancer)發(fā)表的《2014年全球癌癥報(bào)告》稱:2012年全球癌癥患者和死亡病例都在令人不安地增加，中國(guó)新增癌癥病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4種惡性腫瘤中，中國(guó)新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。胃癌(gastriccancer)是發(fā)生在消化系統(tǒng)胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤。它是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病

2、率為25.2/10萬(wàn)，占全部惡性腫瘤死亡的23.2％，居各類腫瘤的首位。早期胃癌多無(wú)癥狀或缺乏典型的臨床表現(xiàn)，普查的依從性差，費(fèi)用較高，大部分病人發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于進(jìn)展期。傳統(tǒng)的治療效果不理想，預(yù)后較差，術(shù)后5年生存率并不能讓人滿意，死亡率仍保持在較高水平。因此尋找一種有效的、新的胃癌治療方法以提高患者的生存率尤為重要。
　　近年來(lái)，分子生物學(xué)的發(fā)展十分迅速，DNA重組技術(shù)日益成熟，基因治療(genetherapy)在基礎(chǔ)研究方面已經(jīng)

3、取得了很大的進(jìn)展，成為了一種新的治療手段。目前腫瘤基因治療包括許多策略，如基因沉默治療、自殺基因療法、反義基因療法、基因替換療法、免疫基因治療、抑癌基因治療、針對(duì)一些細(xì)胞因子的基因治療、針對(duì)耐藥基因的治療、腫瘤DNA疫苗、抗端粒酶療法等幾個(gè)方面。隨著基因治療策略的不斷發(fā)展和載體的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，胃癌自殺基因治療(suicidegenetherapy)有望成為一種腫瘤治療新方法為人們所接受，更多的癌癥患者將從中獲益。本課題組前期研究結(jié)果表明，在

4、survivin基因啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，GFP基因可在胃癌細(xì)胞SGC-7901中表達(dá)，但在正常胃上皮細(xì)胞中不表達(dá)。轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞中有胸苷激酶(thymidinekinase，TK)/胞嘧啶脫氨酶(cytosinedeaminase，CD)(CD/TK)融合基因的表達(dá)，但在轉(zhuǎn)染的正常胃上皮細(xì)胞中未見(jiàn)CD/TK融合基因的表達(dá)產(chǎn)物;轉(zhuǎn)染的胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)前體藥物高度敏感，CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)比任一單自殺基因有更好的殺傷靶

5、細(xì)胞的效果;體內(nèi)接種轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞的裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與任一單自殺基因相比，雙自殺基因系統(tǒng)治療抑制腫瘤的生長(zhǎng)的效果更強(qiáng)更顯著
　　盡管自殺基因治療目前已成功進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，但是要達(dá)到理想的用于臨床治療胃癌的效果還有很大的差距，還有一些問(wèn)題有待解決，比如外源基因的導(dǎo)入尚缺乏特異性和靶向性，載體特異性受體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較低則會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中病毒載體的表達(dá)較低等等。核基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentre

6、gion，MAR)是指真核生物染色質(zhì)中能夠與核基質(zhì)(nuclearmatrix)或核骨架產(chǎn)生特異性結(jié)合的DNA序列，又稱為核骨架附著區(qū)(scaffoldattachmentregion，SAR)。MAR序列的功能主要是參與DNA復(fù)制調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種核生化過(guò)程，同時(shí)MAR可使染色質(zhì)形成獨(dú)立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而避免位置效應(yīng)引起的基因沉默。鑒于MAR序列和基因表達(dá)間的這種關(guān)系，特別是它能顯著地增強(qiáng)外源基因表達(dá)、克服位置效應(yīng)、避免轉(zhuǎn)基因沉默，目

7、前作為一種順式調(diào)控元件已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物工程中。
　　目前，通過(guò)應(yīng)用MAR序列增強(qiáng)survivin啟動(dòng)子介導(dǎo)的CD/TK雙自殺基因表達(dá)系統(tǒng)靶向治療胃癌的研究，迄今為止國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究中我們構(gòu)建并驗(yàn)證了含有MAR序列的由survivin啟動(dòng)子介導(dǎo)的CD/TK雙自殺基因表達(dá)系統(tǒng)是否可以增強(qiáng)對(duì)胃癌細(xì)胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向殺傷作用，結(jié)果表明MAR序列元件可以顯著增強(qiáng)CD/TK雙自殺融合基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性的抑

8、制胃癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有顯著的靶向殺傷作用。研究結(jié)果為胃癌的基因治療提供重要的理論依據(jù)，為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容共分為四部分:
　　第一部分含有MAR的重組pMS-CD/TK雙自殺基因表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的：
　　分別克隆Survivin啟動(dòng)子、CD、TK和MAR基因，構(gòu)建含有MAR的由survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因真核重組表達(dá)載體pMS-

9、CD/TK。
　　方法：
　　1.CD基因全長(zhǎng)序列克隆和分析:設(shè)計(jì)引物，以提取的細(xì)菌E.coli基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CD基因全長(zhǎng)序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-CD，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。
　　2.TK基因全長(zhǎng)序列克隆和分析:設(shè)計(jì)引物，以提取的細(xì)菌E.coli基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增TK基因全長(zhǎng)序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)

10、化細(xì)菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-TK，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。
　　3.Survivin啟動(dòng)子基因序列克隆和分析:設(shè)計(jì)引物，以提取的人Hela細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Survivin啟動(dòng)子基因全長(zhǎng)序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-Sur，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。
　　4.MAR序列克隆和分析:以人β珠蛋白MAR序列為參考設(shè)計(jì)引物，以提取的人Hela細(xì)胞基因組

11、DNA為模板，PCR擴(kuò)增MAR基因全長(zhǎng)序列，回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、篩選獲得重組質(zhì)粒pMD19-MAR，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。
　　5.重組pMS-CD/TK真核表達(dá)載體的構(gòu)建:以質(zhì)粒載體pEGFP-C1為基礎(chǔ)，依次將Survivin啟動(dòng)子基因亞克隆連接構(gòu)建中間載體pEGFP-Sur，再與CD和TK基因連接構(gòu)建中間載體pS-CD/TK，最后將MAR基因序列連接構(gòu)建含有MAR的重組真核表達(dá)載體pMS-

12、CD/TK，并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定成功克隆Survivin啟動(dòng)子基因(948bp)，MAR基因(787bp)，CD基因（約1302bp）和TK基因（約1175bp）。
　　2.經(jīng)不同體系雙酶切和測(cè)序鑒定成功構(gòu)建含有MAR的重組表達(dá)載體pMS-CD/TK和不含MAR的重組表達(dá)載體pS-CD/TK。
　　第二部分重組pMS-CD/TK表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞及表達(dá)分析<

13、br>　　目的：
　　重組表達(dá)載體pMS-CD/TK和pS-CD/TK分別轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901并分析雙自殺基因CD/TK在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.采用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pMS-CD/TK和pS-CD/TK分別轉(zhuǎn)化人胃癌SGC-7901細(xì)胞（靶細(xì)胞）及人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（對(duì)照細(xì)胞）并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。
　　2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Quantitativereal-tim

14、ePCR，qPCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中CD/TK基因表達(dá)量;Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD/TK蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法可有效轉(zhuǎn)染SGC-7901和GES-1細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞組相比，質(zhì)粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK轉(zhuǎn)染組分別擴(kuò)增出一條與預(yù)期CD/TK片段大小相符的特異性條帶，而在GES-1細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組中均檢測(cè)到CD/TK基因的表達(dá)。

15、r>　　2.qPCR結(jié)果顯示，CD/TK基因在轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量是轉(zhuǎn)染pS-CD/TK質(zhì)粒的7.7倍。
　　3.Westernblot結(jié)果也表明，與未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞組相比，在轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK或pS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞中可檢測(cè)到一條單一特異的蛋白條帶。
　　第三部分MAR增強(qiáng)雙自殺基因CD/TK表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體外作用實(shí)驗(yàn)
　　目的：

16、　　觀察MAR序列增強(qiáng)pMS-CD/TK雙自殺基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外殺傷作用。
　　方法：
　　1.SGC-7901和GES-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別加入前體藥物5-FC+GCV，MTT法檢測(cè)前體藥物對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性，計(jì)算細(xì)胞的存活率。
　　2.轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按所設(shè)梯度比例混合，加入5-FC和GCV聯(lián)合用藥治療，MTT檢測(cè)細(xì)胞的存活率以觀察有

17、無(wú)旁觀者效應(yīng)。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，5-FC和GCV聯(lián)合應(yīng)用可以顯著降低轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞的存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與轉(zhuǎn)染pS-CD/TK質(zhì)粒組相比，聯(lián)合應(yīng)用前體5-FC+GCV后轉(zhuǎn)染pMS-CD/TK質(zhì)粒組SGC-7901細(xì)胞的存活率降低顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

18、0.01);與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比，5-FC和GCV對(duì)轉(zhuǎn)染的GES-1細(xì)胞存活率均無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.隨著不斷增加轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例，細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，而且存在明顯的旁觀者效應(yīng)。
　　3.在給予5-FC+GCV前藥處理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率分別為17.65±1.58％、26.25±2.63％，明顯高于未轉(zhuǎn)染組對(duì)照細(xì)胞凋亡率(5.01±0.22％)(

19、P＜0.05)，且pMS-CD/TK轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著高于pS-CD/TK組。
　　第四部分MAR增強(qiáng)雙自殺基因CD/TK表達(dá)對(duì)體內(nèi)裸鼠移植瘤的作用研究
　　目的：
　　觀察含有MAR的雙自殺基因CD/TK表達(dá)系統(tǒng)對(duì)裸鼠胃癌SGC-7901細(xì)胞移植瘤的抑制作用。
　　方法：
　　1.胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型的建立:Balb/c裸鼠右前肢腋窩皮下接種5×106SGC-7901細(xì)胞，第四天原位補(bǔ)種一次，建立

20、胃癌移植瘤動(dòng)物模型。
　　2.雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)裸鼠胃癌移植瘤模型的療效觀察:等到裸鼠移植瘤生長(zhǎng)至直徑約為0.5cm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成3組，6只/每組:A組，空白對(duì)照組，僅用PBS處理;B組，注射重組pS-CD/TK質(zhì)粒聯(lián)合前藥5-FC+GCV治療組;C組，注射重組pMS-CD/TK質(zhì)粒聯(lián)合前藥5-FC+GCV治療組。在給藥治療后每三天測(cè)量各組小鼠的腫瘤大小，計(jì)算瘤體體積，治療結(jié)束時(shí)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取瘤測(cè)瘤重，計(jì)算抑瘤率，取腫

21、瘤組織切片行HE染色，鏡檢觀察腫瘤組織的病理變化。
　　3.qPCR法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織中CD/TK雙自殺基因的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1.成功建立胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，當(dāng)裸鼠成瘤直徑達(dá)0.5cm后開(kāi)始進(jìn)行治療。各實(shí)驗(yàn)組最終瘤重和抑瘤率結(jié)果為:A組:557.1±8.9mg;B組:251.7±14.2mg，63.1％;C組:118.8±10.2mg，82.6％。與對(duì)照組相比，治療組腫瘤體積、最終瘤重和抑瘤率明顯減小，差

22、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　2.腫瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，治療組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞變性壞死及多發(fā)灶性出血散在分布，細(xì)胞分裂相少，伴有纖維組織增生，并可見(jiàn)較多的凋亡小體。
　　3.qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在注射轉(zhuǎn)染pS-CD/TK或pMS-CD/TK質(zhì)粒的移植瘤中檢測(cè)到CD/TK基因的表達(dá)，且后者的表達(dá)量是前者的約2.3倍;而PBS處理對(duì)照組未檢測(cè)到CD/TK基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.成

23、功構(gòu)建含有MAR的由survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因表達(dá)載體系統(tǒng)pMS-CD/TK。
　　2.重組CD/TK融合基因在胃癌細(xì)胞SGC-7901中成功表達(dá)，MAR基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均可明顯增加CD/TK的表達(dá)量。
　　3.雙自殺CD/TK融合基因系統(tǒng)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞具有顯著的殺傷作用且有明顯的旁觀者效應(yīng)。
　　4.MAR序列可通過(guò)增強(qiáng)CD/TK基因的表達(dá)對(duì)胃癌SGC-7901轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生明顯殺