CMVE-pCEA嵌合啟動子驅動的雙自殺基因HSV-TK-CD對不同CEA表達水平的肺癌細胞系的體外殺傷作用研究.pdf

1、廣州醫(yī)學院碩士學位論文CMVE-pCEA嵌合啟動子驅動的雙自殺基因HSV-TK/CD對不同CEA表達水平的肺癌細胞系的體外殺傷作用研究姓名：彭桂林申請學位級別：碩士專業(yè)：外科學（胸外科）指導教師：何建行20090501廣州醫(yī)學院碩士學位論文傷作用的差異以及雙自殺基因的協(xié)同化作用。注：本課題來源于國家自然科學基金資助項目( 3 0 4 7 1 9 9 7 )目的：通過雙自殺基因H S V —T K ／C D 轉染不同C E A 表達水平的

2、肺癌細胞系并進行體外殺傷作用的觀察，確定該系統(tǒng)的靶向性啟動及雙自殺基因表達后化療前體藥物G C V 和5 一F C 對肺癌細胞的殺傷效應和協(xié)同作用，為進一步的臨床實驗提供依據(jù)。方法：使用免疫組化，普通R T - P C R 及熒光定量R T —P C R 的方法鑒定A 5 4 9 ，S P C —A 一1 ，N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 細胞有無C E A 的表達及表達量的差異。然后以E G F P 為觀察對象，使

3、用脂質體2 0 0 0 ，通過條件優(yōu)化，獲得各細胞的最優(yōu)轉染效率，并以此最優(yōu)效率進行目的基因的轉染。把已成功構建并經測序鑒定的重組質粒C M V E —p C E A - I R E S —E G F P 轉染到不同C E A 表達水平的肺癌細胞A 5 4 9 ，S P C - A - I ，N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 中，觀察綠色熒光蛋白的表達，確定C E A 啟動子的靶向性。然后把含有雙自殺基因的載體C M

4、V E - p C E A - T K —I R E S - C D 轉染到C E A 陽性的A 5 4 9 ，S P C - A 一1 細胞中，經G 4 1 8 篩選獲得穩(wěn)定的抗性克隆，并用熒光定量P C R 檢測轉染載體后的A 5 4 9 ／T K + C D ，S P C —A 一1 ／T K + C D 細胞m R N A 中T K ，C D 基因的表達量。W S T —l 法檢測前體藥物單一或聯(lián)合應用對轉染細胞A 5 4 9

5、／T K + C D ，S P C _ A 一1 ／T K + C D的殺傷作用。另外，按不同比例分別混合A 5 4 9 ／T K + C D 和A 5 4 9 細胞，S P C —A 一1 ／T K + C D 和S P C —A 一1 細胞，藥物干預下觀察旁觀者效應。用流式細胞儀檢測不同藥物濃度下單一或聯(lián)合用藥時細胞的凋亡和周期改變情況，用電鏡觀察藥物干預下的細胞超微結構改變。結果：免疫組化，R T —P C R 及熒光定量P C

6、R 檢測發(fā)現(xiàn)A 5 4 9 及S P C —A - l 細胞為C E A陽性細胞，而N C I —H 5 2 0 ，1 6 H B E 細胞為C E A 陰性細胞，且A 5 4 9 細胞的C E A 表達量要明顯高于S P C —A 一1 細胞，轉染C M V E - p C E A - I R E S - E G F P 后，E G F P 的表達量與肺癌細胞內C E A 表達水平相關。各肺癌細胞系的轉染效率均能達到7 0 5 或以上

7、，陰性對照的1 6 H B E 則為5 4 ％。嵌合啟動子C M V E - p C E A 調控下能啟動下游報告基因在C E A 陽性的肺癌細胞A 5 4 9 ，S P C —A 一1 中表達。經G 4 1 8 抗性克隆篩選后，R T - P C R證實T K ／C D 基因導入目的細胞中。5 一F C 和G C V 對A 5 4 9 ／T K + C D ，S P C —A —l ／T K + C D細胞有明顯的細胞毒作用，半數(shù)抑制