腺病毒介導的VEGF啟動子-CD-TK融合基因系統(tǒng)的構建與體外抑瘤研究.pdf

1、目的:一、應用AdEasier-1系統(tǒng)制備含VEGF啟動子驅動的CD/TK融合基因的重組腺病毒質粒,經293細胞包裝、擴增獲取重組腺病毒.行氯化銫密度梯度離心純化,并行PCR鑒定.二、應用含VEGF啟動子驅動的CD/TK融合基因的重組腺病毒感染LOVO細胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫瘤細胞的細胞克隆形成率和細胞存活率以觀察腺病毒介導的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)對大腸癌細胞的體外殺傷

2、效應.方法:一、構建轉移質粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK 首先,用Not Ⅰ和Xho Ⅰ切下pEGFP-1-SV-VEGFP上的VEGFP,亞克隆至pAdtrack構建pAdtrack-VEGFP.再分別以JM109細菌和pREP8-TK為模板,PCR擴增出CD和TK基因片段,亞克隆到中間載體pcDNA3構建含CDglyTK融合基因的pcDNA3-CDglyTK.用HindⅢ和Pvu Ⅱ酶切,回收純化一大小約2.6kb、

3、含polyA尾的片段CDglyTK-pA,插入到穿梭質粒pAdtrack-VEGFP上構建轉移質粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,行酶切鑒定.二、構建重組腺病毒質粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK 用PmeⅠ酶切線性化pAdtrack-VEGFP-CDglyTK,轉化用氯化鈣法制備的AdEasier-1感受態(tài)細菌,使pAdtrack-VEGFP-CDglyTK和腺病毒基因組pAdEasy-1在BJ5183細菌內進

4、行同源重組.抽提質粒,行電泳和Pac Ⅰ酶切鑒定獲取正確的重組腺病毒質粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK.三、293細胞包裝、擴增重組腺病毒 用經Pac Ⅰ酶切線性化的重組腺病毒質粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,按LipofectAMINE2000產品說明書轉染293細胞,通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況.轉染后第14d收集細胞,反復凍融(-70℃,1h/37℃,3min/振蕩,lmin)4次收集病毒上清.取1

5、/2病毒上清感染293細胞,5d后收集細胞,以相同的凍融法收集病毒上清.如此反復取病毒上清感染293細胞進行大量擴增(共4次),收集病毒上清.行氯化銫密度梯度離心法純化并用紫外分光光度計測定重組腺病毒滴度.四、腺病毒介導的VEGF啟動子-CDglyTK融合基因系統(tǒng)對LOVO細胞的體外殺傷作用 應用含VEGF啟動子驅動的CDglyTK融合基因的重組腺病毒感染LOVO細胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫

6、瘤細胞的細胞克隆形成率和細胞存活率.結論:該研究應用AdFasier-1系統(tǒng)制備了含VEGFP驅動CD/TK自殺基因系統(tǒng)的重組腺病毒,并用獲得的重組腺病毒感染LOVO細胞,在前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或更昔洛韋(GCV)作用下,測定腫瘤細胞的細胞克隆形成率和細胞存活率,初步觀察腺病毒介導的CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)對大腸癌細胞的殺傷作用,得出如下結論:1、該實驗于國內首先應用AdEasier-1系統(tǒng)構建重組腺病毒.2

7、、利用AdEasier-1系統(tǒng)可以成功構建含VEGFP驅動CD/TK自殺基因系統(tǒng)的重組腺病毒,成功率為70％,重組腺病毒的滴度達3.2×10<'11>病毒顆粒/m1.3、重組腺病毒能將VEGFP驅動的CD/TK融合基因導入LOVO細胞中并進行有效表達,產生具有生物活性的前藥轉換酶大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶和單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶.4、聯(lián)合應用CD/5-FC和HSV-TK/GCV系統(tǒng)的腫瘤殺傷效應比單獨應用CD/5-FC或HSV-TK/G