CD-TK融合雙自殺基因聯(lián)合GEN治療前列腺癌的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的 前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是美國男性發(fā)病率極高的惡性腫瘤，僅次于肺癌而位于第二位。據(jù)報道到2005年新發(fā)病例達232090例，而死亡率達30350例。在我國發(fā)病率較美國要低，但最近幾年，隨著亞洲及我國人民飲食結構的調整、人口老齡化及醫(yī)療檢測技術水平的提高，前列腺癌的發(fā)病呈逐年上升趨勢。雖然早期前列腺癌的治療可采用根治性前列腺切除術、放療、冷凍療法等，但存在尿失禁和勃起功能障礙等副作用，而且

2、治療后腫瘤仍有復發(fā)可能，晚期前列腺癌尚未有令人滿意的治療手段。 CD基因編碼大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶，能將對細胞無毒的5-氟胞嘧啶轉化為有細胞毒性的代謝產(chǎn)物5-氟尿嘧啶，從而抑制脫氧核苷合成酶和細胞DNA合成而殺死細胞。HSV-TK基因編碼單純皰疹病毒胸苷激酶，能將藥物前體如丙氧鳥苷磷酸化，抑制細胞DNA聚合酶或作為其底物摻入到DNA合成鏈中，使細胞的DNA合成終止從而殺死細胞。國內外不少學者利用逆轉錄病毒或腺病毒介導TK/GCV和

3、CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)進行了各種腫瘤的治療研究，作用效果明顯。國內外有報道表明CD-TK融合雙自殺基因療法在前列腺癌的治療方面顯示出獨特的優(yōu)越性。但是目前基因療效尚未取得令人滿意的效果，主要原因之一是目的基因轉染腫瘤細胞效率低下，同時體外實驗和體內藥物相互作用尚有一定的差距。 大豆提取物染料木黃酮(genistein，GEN)是異黃酮類化合物，其化學名為4，5，7-三羥黃酮，廣泛存在于包括大豆在內的多種蔬菜和水果中。它是非特

4、異性酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制劑，對多種腫瘤的增殖有抑制作用。GEN能明顯誘導前列腺癌細胞凋亡從而殺傷細胞，應用GEN能對腫瘤的生長有一定的抑制作用。GEN給藥途徑一般是口服，在消化吸收的過程中會代謝消耗部分，最后到達腫瘤的藥量很難準確控制。迄今尚未見到兩者聯(lián)合應用的報道，GEN能否提高CD-TK雙融合自殺基因系統(tǒng)的治療效果目前尚不清楚。 本研究嘗試采用CD-TK雙融合自殺基因聯(lián)合GEN(genistein)，對前列腺癌細胞株

5、RM-1進行體內外治療研究，探討兩者聯(lián)合應用的治療效果，為前列腺癌的治療提供實驗依據(jù)。 方法 1、用含有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的復制缺陷腺病毒感染293細胞，擴增腺病毒。超速離心純化腺病毒，用綠色熒光蛋白表達細胞計數(shù)測定腺病毒滴度。 2、用攜帶有CD-TK的腺病毒作載體感染RM-1細胞，獲取含CD-TK基因的RM-1細胞。分別提取未感染以及感染腺

6、病毒的RM-1細胞的RNA，進行RT-PCR反應，電泳鑒定測定CD-TK mRNA的表達。 3、體外培養(yǎng)的未轉染以及轉染CD-TK基因的RM-1細胞的細胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度GCV、5-FC、GEN，GCV濃度為0.0125μg/ml、0.125μg/ml、1.25μg/ml、12.5μg/ml、125μg/ml、1250μg/ml，5-FC濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/m

7、l、320μg/ml，GEN濃度為3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，MTT法測定各組細胞存活率。 4、雄性C57BL/6鼠30只，皮下注射濃度為1×10<'7>/ml RM-1細胞PBS懸液0.1 ml，選取腫瘤大小約80 mm<'3>鼠24只，隨機分成4N，每組6只，第1組為對照組：RM-1(注射PBS)；第2組為GEN組：RM-1/GEN(無腺病毒

8、注射組)；第3組為腺病毒；0HGCV+5-FC治療組(Adv+GCV+5-FC)：RM-1/(Adv+GCV+5-FC)；第4組為聯(lián)合治療組：RM-1/(Adv+GCV+5-FC+GEN)。第3-4組分別進行瘤體內多點注射腺病毒，每次100μl，每天1次，連續(xù)3 d，第1-2組僅在瘤體內多點注射PBS每次100μl，每天1次，連續(xù)3 d。從第4天開始治療組(3-4組)腹腔內注射GCV和5-FC，GCV 100 mg·kg<'-1>，5-

9、FC 300 mg·kg<'-1>，第2組腹腔內注射GEN33.3 mg．kg<'-1>，第1組腹腔內注射PBS 100μl，連續(xù)10 d。之后再觀察2 d結束實驗，測量各鼠腫瘤大小，取出各組鼠腫瘤進行組織病理學檢查。用免疫組織化學S-P法對4組前列腺癌組織切片行bcl-2的免疫組化染色，采用人工閱片判斷前列腺癌組織bcl-2的染色程度。5、應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用析因設計資料的方差分析，以P<0.05為具

10、有統(tǒng)計學意義的標志。 結果 1、293細胞能大量擴增腺病毒，純化后腺病毒滴度可達1.58×10<'10>PFU/ml。 2、經(jīng)RT-PCR擴增感染腺病毒的RM-1細胞出現(xiàn)大小為233bp的CD基因片段和234bp的TK基因片段，而未感染腺病毒的RM-1細胞未出現(xiàn)相應片段，表明感染腺病毒的RM-1細胞中有CD和TK基因mRNA表達。 3、當GCV為12.5μg/ml以及5-FC為80μg/ml時，細胞絕大部

11、分存活；當GCV為125μg/ml以及5-FC為160μg/ml時，細胞存活率明顯下降；當GCV為1250μg/ml以及5-FC為320μg/ml時，細胞幾乎都凋亡。當GCV、5-FC聯(lián)合應用時，抑制率明顯增加。在相應各種前藥濃度下，雙基因組與單基因組差異有顯著性(P<0.05)。 4、當GEN濃度小于50μg/ml且單獨應用時時，RM-1細胞的存活率維持在80％以上，殺傷作用不是很明顯。蛤當CD-TK基因和GEN兩者聯(lián)合應用時

12、，RM-1細胞的存活率維持在15％以下，聯(lián)合組與單獨用GEN組相比較有明顯差異(P=0.00)。也就是說，在聯(lián)合治療組中CD-TK雙基因殺傷RM-1細胞，僅加用極微量GEN就達到理想殺傷效果。 5、體內實驗結束時對照組鼠腫瘤體積為1008.73±126.73 mm<'3>，單用雙基因、GEN組的腫瘤體積分別為222.60±26.79 mm<'3>、359.06±53.17mm<'3>，這兩組體積明顯小于對照組(P=0.00)。而

13、聯(lián)合治療組腫瘤體積為25.31±9.24 mm<'3>，明顯小于前面3組(P=0.00)。6、組織病理學HE染色見治療組均出現(xiàn)細胞壞死凋亡，基因組治療效果比GEN好，其中以聯(lián)合應用組最為明顯，僅于周邊見少量活腫瘤細胞。 7、超高敏SP免疫組化法檢測bcl-2的表達，見PBS組呈強陽性(+++)：GEN組介乎強陽性與中度陽之間；基因組為中度陽性(++)；聯(lián)合治療組呈弱陽性(+)。 結論 1、腺病毒載體能有效地將胞嘧

14、啶脫氨酶和胸苷激酶(CD-TK)融合雙自殺基因導入前列腺癌RM-1細胞中表達。 2、CD-TK融合自殺基因聯(lián)合應用在體外對RM-1前列腺癌細胞有協(xié)同殺傷作用，療效優(yōu)于單一自殺基因。 3、GEN對RM-1細胞有一定得抑制作用，且能增強CD-TK融合自殺基因系統(tǒng)對RM-1的殺傷作用。 4、CD-TK融合自殺基因能明顯抑制鼠體內前列腺癌的生長，且效果優(yōu)于GEN，而兩者聯(lián)合應用效果最好，GEN能增強CD-TK融合自殺基因