VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD-TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)Balb-c小鼠大腸癌的治療作用及腫瘤微環(huán)境影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大腸癌是常見的惡性腫瘤之一,在過去二十多年中世界大多數(shù)國(guó)家或地區(qū)的大腸癌發(fā)病率里上升趨勢(shì),每年死于結(jié)腸癌的病例日益增加。在西方國(guó)家,大腸癌居于癌癥相關(guān)死亡率的第二位,僅次于肺癌。大腸癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。目前以外科手術(shù)為主和化療、放療為輔的綜合治療是大腸癌主要的治療手段,但對(duì)于進(jìn)展期腸癌來說,療效仍難以令人滿意,術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要因?yàn)?。基因治療為傳統(tǒng)的治療方法提供了新的輔助治療手段,是未來腫瘤治愈的希望

2、所在。腫瘤的自殺基因療法,又稱酶前藥治療,是通過基因工程的手法將特定的自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,自殺基因能編碼產(chǎn)生相應(yīng)的酶,將不具活性的無(wú)毒或低毒前體藥物轉(zhuǎn)化為具有短期活性的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物,從而在腫瘤局部產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的高濃度的細(xì)胞毒作用藥物,達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。另外,自殺基因治療尚存在所謂旁觀者效應(yīng)(bystander effect),是指不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因的腫瘤細(xì)胞在給予前體藥物后被殺死,其相鄰或更遠(yuǎn)的未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞也可被殺死

3、的現(xiàn)象,旁觀者效應(yīng)明顯擴(kuò)大了自殺基因的殺傷范圍,因而在理論上,自殺基因治療是具有靶向性和高效性的基因治療手段。
　　 目前較深入研究的自殺基因治療系統(tǒng)有HSV-TK/GCV和CD/5-FC等,但單自殺基因系統(tǒng)存在殺腫瘤效力不足的問題。本課題組從事自殺基因的研究多年,構(gòu)建的CD/TK.雙自殺基因治療系統(tǒng)比CD或TK單自殺基因系統(tǒng)具有更大的優(yōu)越性,在前期對(duì)荷瘤裸鼠的研究中,該雙自殺基因治療系統(tǒng)已表現(xiàn)出比單自殺基因系統(tǒng)更強(qiáng)的抗腫瘤作用

4、。但雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)具有免疫活性的機(jī)體是否具有同樣的抗腫瘤作用尚需進(jìn)一步證實(shí),另外,雙自殺基因系統(tǒng)與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系尚未明確,有待進(jìn)一步研究。因此,本實(shí)驗(yàn)以大腸癌CT26細(xì)胞和Balb/c小鼠為對(duì)象,研究VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK.雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)具有免疫活性的大腸癌Balb/c荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)、增殖的影響,同時(shí)初步闡明雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)腫瘤微環(huán)境的作用,為提高雙自殺基因的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),本實(shí)驗(yàn)可分為三部分:
　　 第

5、一部分VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒的培養(yǎng)、擴(kuò)增、純化和鑒定。
　　 目的:擴(kuò)增純化出雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK,并測(cè)定病毒滴度和感染復(fù)數(shù),為下一步的實(shí)驗(yàn)提供雙自殺基因系統(tǒng)。
　　 方法:將本實(shí)驗(yàn)課題組構(gòu)建并保存的Ad-VEGF-GFP-CD/TK重組腺病毒復(fù)蘇,轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,待293細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)后,以凍融法釋放重組腺病毒,用重組腺病毒反復(fù)轉(zhuǎn)染HEK-29

6、3細(xì)胞以擴(kuò)增病毒,用普通倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和電鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,最后采用氯化銫密度梯度離心法純化病毒,終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒的滴度。以病毒DNA為模板,用融合基因CD/TK及啟動(dòng)子VEGF序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng),將產(chǎn)物電泳以鑒定目標(biāo)基因的存在。
　　 結(jié)果:
　　 復(fù)蘇的重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后,于普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察,可見293細(xì)胞病變現(xiàn)象；于熒光顯微鏡下觀察,可見綠色熒光蛋白的表達(dá)；于電鏡下觀察,可見大

7、量重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞。PCR產(chǎn)物電泳后可見2400bp和296bp條帶,與構(gòu)建的目標(biāo)重組腺病毒的插入片段大小相符,證明成功擴(kuò)增出雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK。重組腺病毒滴度一般可達(dá)109-1010pfu/ml。MOI=100為最佳感染復(fù)數(shù)。
　　 第二部分 CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)Balb/c小鼠大腸癌的治療作用
　　 目的:研究CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)具有免疫活性的大腸癌Bal

8、b/c荷瘤小鼠的治療作用。
　　 方法:大腸癌CT26細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增,以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞皮下接種Balb/c小鼠背部,建立荷瘤小鼠模型；以移植瘤直徑達(dá)到0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn),取腫瘤大小均勻、無(wú)出血壞死的100只荷瘤小鼠隨機(jī)分為重組腺病毒加前藥組(Ⅰ組)、重組腺病毒組(Ⅱ組)、前藥組(Ⅲ組)、陰性對(duì)照組(Ⅳ組)四組,每組25只小鼠。依不同組別,分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒(Ⅰ組,Ⅱ組)、腹腔注射前藥GCV或5-FC(Ⅰ組,Ⅲ組)或

9、注射生理鹽水(Ⅳ組),共治療2周。觀測(cè)開始治療后第3、7、14天腫瘤體積的變化；第15天每組處死15只小鼠,稱瘤重及計(jì)算抑瘤率；Tunel法原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡；每組剩余10只小鼠繼續(xù)觀測(cè)總生存期。
　　 結(jié)果:
　　 1.用大腸癌CT26細(xì)胞皮下接種法成功地建立Balb/c荷瘤小鼠模型。
　　 2.雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)大腸癌Balb/c荷瘤小鼠的腫瘤增長(zhǎng)有抑制作用。雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組比較,治療前腫

10、瘤體積差異無(wú)顯著性(P均大于0.05),但在治療后第3天、7、14天,小鼠的腫瘤體積差異均有顯著性(P均為0.000),雙自殺基因治療組在治療后各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積較非雙自殺基因治療組明顯減小。治療結(jié)束后,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組的瘤重比較,差異也有顯著性(P均小于0.05),雙自殺基因治療組的瘤重較非雙自殺基因治療組減輕。
　　 3.Tund法原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率有顯

11、著影響,雙自殺基因系統(tǒng)治療組的凋亡率遠(yuǎn)高于非雙自殺基因治療組。
　　 4.經(jīng)單療程(2周)治療后,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組小鼠的總生存期無(wú)顯著性差異(X2=4.382,P=0.223),說明單療程的雙自殺基因系統(tǒng)治療不能影響荷瘤小鼠的總生存期。
　　 第三部分 CD/TK雙自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)腫瘤微環(huán)境影響的評(píng)估
　　 目的:探討CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響,以及此種影響與雙自殺基因系統(tǒng)的

12、抗腫瘤效應(yīng)關(guān)系。
　　 方法:如第二部分的方法重新建立荷瘤小鼠模型,成瘤標(biāo)準(zhǔn)同前,120只荷瘤小鼠隨機(jī)分為重組腺病毒加前藥組(A組)、重組腺病毒組(B組)、前藥組(C組)、陰性對(duì)照組(D組)四組,每組30只小鼠；依不同組別,分別瘤內(nèi)注射重組腺病毒(A組,B組)、腹腔注射前藥GCV或5-FC(A組,C組)或注射生理鹽水(D組),共治療2周。用不連續(xù)密度梯度離心法分離腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞；Annexin-V/PI法檢測(cè)單個(gè)腫瘤

13、細(xì)胞的凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫痛浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群CD3+CD4+和CD3+CD8+的變化；ELISA法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)IFNγ、IL-2、IL-4,IL-12、TNFα的表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)大腸癌組織中CD34、VEGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1 Annexin-V/PI法檢測(cè)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的凋亡率。雙自殺基因系統(tǒng)治療組較非雙自殺基因治療組腫瘤細(xì)胞的凋亡率大幅增加,與Tunel法原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)論基本一致。

14、r>　　 2.CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)能影響B(tài)alb/c小鼠腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞和因子的水平。與非雙自殺基因治療組相比,雙自殺基因治療組腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+均升高,并且腫瘤微環(huán)境中IFNγ、IL-2和IL-12的表達(dá)水平也增加(P=0.000)；但,雙自殺基因治療組與非雙自殺基因治療組腫瘤微環(huán)境中的IL-4、TNFα的表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P均大于0.05)。
　　 3.CD/TK雙自殺基因系

15、統(tǒng)能影響腫瘤微血管的生成,治療后的小鼠腫瘤組織微血管密度(MVD)的明顯減小,同時(shí)腫瘤組織中的VEGF的表達(dá)水平也下降。
　　 全文結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功包裝、擴(kuò)增出VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒Ad-VEGF-GFP-CD/TK。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)成功地建立成瘤率高的大腸癌Balb/c荷瘤小鼠模型。
　　 3.我們發(fā)現(xiàn)CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)具有免疫活性的大腸癌Balb/c荷

16、瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)同樣具有抑制作用,并能誘導(dǎo)大量腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 4.我們首次觀察到單療程(2周)的CD/TK雙自殺基因系統(tǒng)治療對(duì)Balb/c荷瘤小鼠的總生存期無(wú)影響,提示要延長(zhǎng)Balb/c荷瘤小鼠的生存期可能需進(jìn)行多療程的綜合治療。
　　 5.我們發(fā)現(xiàn)雙自殺基因系統(tǒng)能誘導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群的升高,并使腫瘤微環(huán)境中IFNγ、IL-2和IL-12的表達(dá)水平增加,但對(duì)IL-4、TNF