溶藻弧菌外膜蛋白DNA重組表達載體的構建及兔抗大黃魚IgM血清制備.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena Crocea)是我國單一品種養(yǎng)殖量最大的海水魚類，被農(nóng)業(yè)部確定為我國六種最具優(yōu)勢出口水產(chǎn)品之一。然而，隨著人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖大黃魚病害問題日趨嚴重，其中溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)是養(yǎng)殖大黃魚最常見的病原菌，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。病害防治事關大黃魚養(yǎng)殖成敗和可持續(xù)健康發(fā)展。DNA疫苗作為一種新興的免疫防治手段，在最近幾年內(nèi)發(fā)展較快。DNA疫苗的免疫原性和免疫保護

2、作用的有效性已經(jīng)在大范圍的動物模型試驗中得到了證明，有著良好的應用前景。本文以大黃魚為對象，構建了對大黃魚養(yǎng)殖和人體健康構成嚴重威脅的溶藻弧菌的外膜蛋白W的真核表達重組DNA，同時制備了兔抗大黃魚IgM抗血清，為進一步研究溶藻弧菌DNA疫苗奠定了良好的基礎。具體內(nèi)容如下： 分別用飽和硫酸銨二次鹽析法和蛋白A親和層析法對健康大黃魚血清中的免疫球蛋白(IgM)進行分離純化，所得產(chǎn)物用SDS-pAGE進行檢測。結果表明：蛋白A親和層析

3、法可以較好地分離到高純度的大黃魚血清IgM，產(chǎn)物的電泳膠中只有重鏈和輕鏈2個條帶；飽和硫酸銨二次鹽析法除了有這2個條帶，還有很多雜帶，而且蛋白A親和層析法更為簡便、快速，因此用蛋白A親和層析法分離純化IgM優(yōu)于飽和硫酸銨二次鹽析法；大黃魚免疫球蛋白重鏈的分予量在76kOat左右；輕鏈分子量在28kDa左右。用純化的大黃魚IgM免疫實驗兔，獲得效價高達1:40960的兔抗魚IgM血清。本文所建立的蛋白A親和層析法提取大黃魚血清IgM可以方

4、便、快捷地獲得高純度的產(chǎn)物，適合在實驗室中純化魚類IgM。本研究所制備的兔抗大黃魚IgM血清為今后的相關研究工作打下了堅實的基礎。 細菌外膜蛋白被認為具有較強的抗原性，本文選定溶藻弧菌外膜蛋白w(GetleBarlk編號AY944132)為抗原基因設計引物，基因大小642個堿基，上游引物5’端加入HindⅢ酶切位點，下游引物5’端加入ECOV Ⅰ酶切位點。用PCR法克隆了溶藻弧菌外膜蛋白W基因，退火溫度為45℃。經(jīng)l％瓊脂糖電泳

5、檢測，PCR產(chǎn)物長度與預期相符，測序檢驗發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物與溶藻弧菌外膜蛋白w基因序列的同源性為98％。以DcDNA3.1(+)為真核表達載體，與PCR產(chǎn)物分別進行雙酶切后，以T4DNA連接酶進行連接，構建重組子。連接產(chǎn)物轉化入大腸桿菌JM109，經(jīng)氨卞青霉素篩選后，取陽性菌落提取質粒雙酶切后，通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測證明插入片斷大小正確，測序結果同源性為98％，至此成功構建溶藻弧菌外膜蛋白w的真核表達載體并命名為pcDNA3.1(+)-