創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗載體的構(gòu)建及表達(dá)分析.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），又名海洋弧菌，其屬于弧菌屬，是一種革蘭氏陰性，嗜鹽性的桿狀細(xì)菌，常存在于海鮮與海水中，能引起水產(chǎn)魚類疾病。鰻鱺感染此菌可引起出血病，且發(fā)病速度快，死亡率高，對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治此病主要是使用廣譜類抗菌藥物，基于食品安全和環(huán)境保護(hù)的理念，研發(fā)相關(guān)特異性疫苗已迫在眉睫。本研究以創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2株的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK為目的基因，構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗真核表

2、達(dá)載體pcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk，并在真核細(xì)胞中檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，具體如下：
　　FJ03-X2株為本實(shí)驗(yàn)室于2003年在福建長(zhǎng)樂某鰻鱺場(chǎng)分離、鑒定和保存。根據(jù)GenBank記載創(chuàng)傷弧菌ATCC29307株lpp基因序列和創(chuàng)傷弧菌1.1758株ompk基因序列，設(shè)計(jì)引物，首次克隆到創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2株的lpp和ompk基因。利用在線網(wǎng)絡(luò)分析兩種蛋白的親疏水性，抗原表位、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。構(gòu)

3、建pMD18-T-lpp和pMD18-T-ompk重組質(zhì)粒，獲得基因片段。
　　構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-lpp和pET-32a-ompk，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）表達(dá)蛋白。SDS-PAGE電泳檢測(cè)，加上標(biāo)簽后，Lpp蛋白大小為47kDa，OmpK蛋白大小為45kDa，符合預(yù)期結(jié)果。純化目的蛋白，并免疫SPF級(jí)SD大鼠，獲得大鼠多克隆抗血清。ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，鼠抗Lpp蛋白血清和鼠抗OmpK蛋白血清效價(jià)均

4、為1:128000。免疫印記實(shí)驗(yàn)證明多克隆抗血清可識(shí)別創(chuàng)傷弧菌的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK。經(jīng)檢測(cè)，兩種抗血清均具有較高的特異性。
　　構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗真核表達(dá)載體pcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk。將帶有目的基因的質(zhì)粒與pEGFP-N1（綠色熒光蛋白基因）以10:1的比例，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，48h后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并通過RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA水平的表達(dá)，Western-blot檢測(cè)