早期應用抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗對旱獺WHV感染過程的影響.pdf

1、目的：
　　1.研究不同地區(qū)旱獺對 WHV的易感性,了解不同毒株、不同劑量的WHV接種旱獺后的自然經(jīng)過,完善 WHV感染的旱獺模型,。
　　2.建立旱獺 T淋巴細胞免疫應答的檢測方法。
　　3.研究恩替卡韋聯(lián)合 DNA疫苗 pWHcIm對 WHV感染的早期干預作用。
　　方法：
　　1.捕獲來自不同地區(qū)的旱獺,靜脈接種含有 WHV病毒的血清,觀察其對 WHV的易感性;用不同的WHV毒株接種易感地區(qū)的旱獺,觀

2、察不同毒株的影響;分別用高,中,低劑量的WHV59毒株接種易感地區(qū)的旱獺,觀察不同劑量的WHV接種后的自然經(jīng)過。
　　2.分離旱獺PBMC,建立旱獺T細胞應答的檢測方法,包括CFSE染色檢測旱獺 PBMC增殖,CD107a檢測旱獺特異性 CTL應答,PD1,PDL1,FOXP3染色及其免疫應答相關分子 mRNA表達的real-time RT-PCR的方法。
　　3.野外捕獲的成年旱獺24只,體重在2-3kg。經(jīng)足背靜脈接種含

3、有 WHV59病毒的血清,病毒接種后24小時,18只旱獺分別經(jīng)過如下三種處理:口服抗病毒藥物恩替卡韋,0.5mg/kg/day,持續(xù)服用8周;在接種病毒后的第1,4,7周用表達 WHV核心抗原的質粒免疫;口服恩替卡韋聯(lián)合質粒免疫。余下6只旱獺作為空白對照。20周后,旱獺接種 WHV0908毒株。選擇2只健康旱獺作為此次病毒接種的對照。應用ELISA、real-time-PCR檢測旱獺血清 WHV感染標志物的動態(tài)變化:WHsAg、WHsA

4、b、WHcAb和WHV DNA。real-time-RT-PCR檢測旱獺 PBMC中免疫應答相關分子的表達。
　　結果：
　　1.來自1,3地區(qū)的喜馬拉雅旱獺對 WHV易感,病毒呈現(xiàn)高復制;WHV59毒株使喜馬拉雅旱獺出現(xiàn)急性感染,而WHV59的傳代毒株(stock0908和stock0925)使旱獺同樣出現(xiàn)急性感染;中劑量 WHV59接種后旱獺出現(xiàn)病毒血癥的時間延遲,而低劑量 WHV接種旱獺后不能出現(xiàn)病毒血癥。
　　

5、2.新鮮分離的旱獺 PBMC進行 CFSE染色,5μg/ml的ConA刺激旱獺淋巴細胞5天, CFSEdim CD4+細胞百分比高達92.15％。新鮮分離急性 WHV感染旱獺的PBMC,2μg/ml WHc96-110的肽段特異性刺激3天后,CD3+CD4-CD107a的表達為3.98％,相比2μg/ml CMV無關多肽刺激(0.85％)和空白對照(0.67％)有明顯的增高。在病毒血癥高峰期,CD4-細胞的PD-1表達達到高峰,陽性細胞

6、百分比達到13.77％, CD4+細胞的FOXP3的表達為4.44％,PD-L1在病毒血癥晚期 CD4+和CD4-T細胞均有短暫上調,其百分比分別為2.17％和6.05％,病毒清除后降至正常水平。
　　3.24只成年旱獺初次 WHV感染后,所有僅用DNA疫苗免疫的旱獺均出現(xiàn)病毒血癥和核心抗體,與未處理的對照旱獺相似。除僅用恩替卡韋處理的2只旱獺未出現(xiàn)WHcAb外,恩替卡韋聯(lián)合質粒免疫及僅用恩替卡韋處理的所有旱獺均出現(xiàn)WHcAb而未

7、出現(xiàn)病毒血癥。再次病毒接種后,所有的質粒免疫旱獺,恩替卡韋聯(lián)合質粒免疫的旱獺以及未處理的對照動物及其部分僅用恩替卡韋處理的旱獺(4/6)均不出現(xiàn)病毒血癥。
　　結論：
　　1.旱獺的遺傳背景及病毒的接種劑量影響 WHV感染的結局,傳代病毒接種產(chǎn)生與原代病毒感染類此的感染結局。
　　2.建立了旱獺 T細胞應答的檢測方法,為旱獺 WHV感染模型應用于 HBV感染的免疫發(fā)病機制研究及評估免疫治療策略提供研究手段。
　　

8、3.早期應用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合 DNA疫苗,可以抵御 WHV的初次感染,且部分或全部旱獺產(chǎn)生了有效的保護性免疫應答,可以抵御 WHV的再次感染。
　　本研究的創(chuàng)新點及意義：
　　1.旱獺廣泛分布在我國西北特別是青藏高原,與土撥鼠種系(線粒體 DNA序列分析)發(fā)生十分接近,近年已經(jīng)報道中國旱獺對 WHV有易感性,因此 WHV感染旱獺模型非常適合于研究嗜肝病毒的急慢性感染。
　　2.首次在旱獺 WHV感染模型體

9、內建立 T淋巴細胞應答的檢測方法,包括 CFSE染色檢測淋巴細胞增殖,CD107a及流式細胞術分析特異性 CTL應答,real-time RT-PCR檢測細胞因子表達,為旱獺模型的進一步推廣應用提供研究手段。
　　3.首次利用WHV感染旱獺模型研究早期應用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗對 WHV感染過程的影響,為探討 HBV感染后的早期免疫應答及保護性免疫應答的產(chǎn)生提供重要的實驗依據(jù),并為 HBV意外或針刺暴露者提供新的