整合素αvβ3受體靶向性新型分子探針的近紅外熒光成像研究.pdf

1、研究目的：整合素αvβ3在血管生成相關(guān)疾病中起關(guān)鍵作用，因此是血管生成的一個(gè)特征性標(biāo)記物，可作為血管生成相關(guān)疾病分子成像的有效靶點(diǎn)。本研究利用近紅外熒光染料Cy5.5標(biāo)記本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的結(jié)締組織生長因子多肽(命名為Plc，專利公開號(hào)：CN101497656)構(gòu)建的一種新型近紅外熒光分子探針(Cy5.5-Plc)，對(duì)高表達(dá)整合素αvβ3受體的人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型進(jìn)行腫瘤及腫瘤血管的活體近紅外光學(xué)成像研究，評(píng)價(jià)其整合素α

2、vβ3的靶向性，從而為臨床αvβ3靶向近紅外成像、血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究及診療提供一種新方法。
　　研究方法：1.使用I-TASSER服務(wù)器進(jìn)行Plc多肽的結(jié)構(gòu)模擬，用軟件MOE的DOCK模塊進(jìn)行了Plc與αvβ3的分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過分段置換、三角匹配、能量最小化等步驟，以獲得Plc與αvβ3的對(duì)接模型；通過固相結(jié)合實(shí)驗(yàn)(solid phase binding assay)測(cè)定Plc與αvβ3結(jié)合的特異性。2.流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)的整合素αvβ3受體表達(dá)情況；FITC-Plc(實(shí)驗(yàn)組)、Plc+FITC-Plc(競(jìng)爭(zhēng)組)分別與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共孵育，激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細(xì)胞對(duì)Plc的攝取情況。3.建立人MDA-MB-231乳腺癌裸鼠移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注射Cy5.5-Plc(1nmol/只)，并設(shè)立競(jìng)爭(zhēng)組(尾靜脈預(yù)注射10mg/kg未標(biāo)記的Plc)、對(duì)照組(尾

4、靜脈注射1nmol染料Cy5.5)，分別在1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)連續(xù)進(jìn)行活體近紅外熒光成像；對(duì)注射Cy5.5-Plc(1nmol/只)8h后的荷瘤裸鼠的離體腫瘤組織及主要器官組織(心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、骨骼、肌肉)進(jìn)行近紅外熒光成像；取荷瘤鼠離體腫瘤組織行病理切片HE染色，并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)整合素αvβ3受體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.計(jì)算機(jī)對(duì)接實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鲲@示，Plc是一個(gè)隨機(jī)卷曲的線性肽，可以與αvβ3形

5、成8對(duì)氫鍵，并以緊密結(jié)合的方式橫跨于αv和β3兩個(gè)亞基之間；固相受體結(jié)合測(cè)定顯示Plc能與αvβ3特異性結(jié)合。2.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示MDA-MB-231細(xì)胞的整合素αvβ3受體陽性表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡顯示實(shí)驗(yàn)組FITC-Plc在MDA-MB-231細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核均有分布，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞主要分布在細(xì)胞漿，而競(jìng)爭(zhēng)組均無明顯攝取。3.近紅外熒光成像顯示實(shí)驗(yàn)組注射Cy5.5-Plc探針后8小時(shí)腫瘤部位與對(duì)側(cè)正常組織的熒光強(qiáng)度比值(

6、T/N)達(dá)最大，且實(shí)驗(yàn)組T/N在8小時(shí)和24小時(shí)明顯高于競(jìng)爭(zhēng)組(P<0.05)，在1小時(shí)和4小時(shí)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；離體MDA-MB-231腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯高于其它正常組織；腫瘤組織HE染色顯示為低分化腺癌，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示腫瘤組織有豐富的微小血管網(wǎng)且整合素αvβ3受體表達(dá)陽性。
　　結(jié)論：Plc能與整合αvβ3特異性結(jié)合；Plc存體外細(xì)胞水平上對(duì)陽性表達(dá)整合素αvβ3的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有良