靶向肝細胞癌GPC3受體的新型分子探針的研制及熒光和PET顯像研究.pdf

1、目的:一、合成GPC3受體靶向多肽L5并驗證該多肽與肝細胞癌細胞的結合能力，為進一步探針制備和肝細胞癌靶向性顯像研究奠定基礎。
　　二、用5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標記L5多肽，制備熒光探針（FAM-L5），并用熒光顯像方法研究該熒光探針的靶向性。
　　三、用正電子核素18F標記靶向多肽L5制備PET分子探針(18F-L5)，通過micro-PET/CT顯像，研究該探針用于肝細胞癌顯像

2、的可行性。
　　方法: 一、靶向GPC3受體多肽L5及其熒光多肽FAM-L5的合成
　　1.GPC3靶向多肽L5的化學合成。
　　2.熒光標記靶向肽FAM-L5的合成。
　　3.NOTA修飾多肽L5由中肽公司合成。
　　二、熒光多肽FAM-L5的體外結合試驗
　　1.免疫熒光檢測肝細胞癌HepG2細胞及正常肝細胞HL-7702細胞GPC3的表達
　　2.體外肝細胞癌細胞株HepG2同熒光多肽FA

3、M-L5的結合及競爭抑制試驗
　　三、熒光多肽FAM-L5的體內試驗
　　1.裸鼠腫瘤模型的建立及確定
　　2.FAM-L5在腫瘤組織及正常組織臟器內的攝取及分布研究
　　3.FAM-L5在荷肝細胞癌腫瘤模型體內的熒光生物學分布研究
　　4.熒光顯像分析
　　四、PET分子探針18F-L5的合成和micro PET/CT顯像研究
　　1.PET分子探針的合成
　　2.Micro PET/C

4、T顯像
　　結果：一、靶向GPC3受體多肽及其熒光多肽FAM-L5的合成
　　1.GPC3靶向肽L5的合成。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示L5純度為99.15％。
　　2.FAM標記熒光多肽FAM-L5的合成。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示，F(xiàn)AM-L5的純度為98.44％。
　　3.NOTA修飾L5的合成。經(jīng)HPLC純化、分析結果顯示，NOTA-L5的純度為95.4％。
　　4.驗證肝細胞癌HepG2細胞和人

5、正常肝細胞HL-7702細胞表達GPC3受體的實驗:經(jīng)過細胞免疫熒光試驗，共聚焦顯像顯示肝細胞癌HepG2細胞高表達GPC3受體，而人正常肝細胞HL-7702細胞低表達GPC3受體。
　　5.熒光多肽FAM-L5與細胞的結合實驗
　　二、熒光多肽FAM-L5的體內試驗
　　1.裸鼠腫瘤模型的建立
　　4周齡無胸腺裸鼠皮下接種HepG2細胞，飼養(yǎng)14天左右可見腫瘤結節(jié)，待4至6周腫瘤增大至1.0cm左右用于試驗。共

6、接種6批，每批5只，共30只，其中25只成瘤，5只無腫瘤生長，成瘤率為83.3％。將其中1個腫瘤切下來進行病理組織學檢測，病理結果顯示符合肝細胞癌改變。
　　相同條件的無胸腺裸鼠皮下接種U87MG細胞，飼養(yǎng)14天左右可見腫瘤結節(jié)，待4-6周腫瘤增大至1.0cm進行試驗。共接種3批，每批5只，共15只，其中12只成瘤，3只無腫瘤生長，成瘤率為80％。其中1只腫瘤切下來進行病理組織學檢測，病理結果顯示符合腦膠質瘤改變。
　　2.

7、熒光多肽FAM-L5在腫瘤組織中的攝取及分布研究
　　經(jīng)荷肝細胞癌裸鼠尾靜脈注射FAM-L5（1mM，150μL）1小時后，分離腫瘤組織，制作切片觀察熒光標記多肽在腫瘤內的分布情況，結果顯示腫瘤組織內可見明顯熒光聚集。分離正常肝組織制作切片，觀察到正常肝組織內有熒光分布但熒光強度明顯低于腫瘤組織。
　　三、肝細胞癌FAM-L5熒光受體顯像研究
　　研究結果顯示注射FAM-L51小時后，肝細胞癌HepG2腫瘤組織內呈現(xiàn)F

8、AM-L5明顯高攝取，而正常的肝臟組織僅見熒光輕微攝取，相對熒光強度腫瘤/肝臟比值為14.28±7.90。從體內分布看，該熒光多肽主要通過膽囊-腸道途徑排泄，注射1小時后，大部分熒光分布于膽囊及腸道內。腦、雙肺、心臟、脾臟、雙腎及肌肉組織內熒光分布均很低，提示非特異性攝取低。
　　對照腫瘤人腦膠質瘤U87MG，靜脈注射FAM-L51小時后，U87 MG腫瘤部分熒光攝取較低，僅略高于正常肝臟組織，其腫瘤/正常肝臟比值為1.44±0.

9、53。兩種腫瘤攝取FAM-L5的相對熒光強度比較，肝細胞癌HepG2腫瘤攝取FAM-L5的相對熒光強度明顯高于腦膠質瘤U87MG(14.28±7.90 vs1.44±0.53, t=3.69,P=0.008)。
　　四、PET分子探針18F-L5的研制及PET/CT顯像研究
　　1.18F-NFP-L5和18F-AlF-NOTA-L5的放化標記
　　18F-NFP-L5的放化標記:以18F-NFP為前體順利合成了18F

10、-NFP-L5，實現(xiàn)了靶向多肽L5的放射性標記。總標記時間為180-200min，標記產物率約為10％，經(jīng)HPLC測定合成產物的純度為98.45％。
　　18F-Al18F-NOTA-L5的放化標記:以NOTA-L5為反應前體，采用Al18F螯合反應，實現(xiàn)18F標記NOTA-L5。總標記時間為60min，標記率為50％-69.8％。
　　2.荷瘤裸鼠micro PET/CT顯像研究
　　結論：1.本研究成功合成了靶向G

11、PC3受體的多肽L5，合成純度為99.15％，可滿足研究需要。
　　2.成功用FAM標記L5，成功制備熒光探針FAM-L5，純度為98.44％，可滿足體內及體外反應的需求。
　　3.體外熒光探針FAM-L5與細胞的結合試驗表明FAM-L5能被高表達GPC3受體的細胞HepG2大量攝取，其攝取符合受體-配體競爭結合規(guī)律。
　　4.腫瘤組織熒光顯像研究表明:熒光多肽FAM-L5能在肝細胞癌腫瘤組織中大量聚集。
　　5

12、.正常裸鼠體內FAM-L5的熒光生物學分布研究顯示FAM-L5主要經(jīng)膽腸系統(tǒng)排泄。
　　6.成功合成了PET探針18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5，其中18F-NOTA-L5標記率為14.6％-69.8％，標記率較高，可以進行大量動物試驗。
　　7.經(jīng)micro PET/CT顯像研究顯示，18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5能靶向肝細胞癌腫瘤組織。
　　8.FAM-L5、18F-NFP-L5及18F-