α-,v-β-,3-整合素受體靶向性超順磁性脂質體的合成及腫瘤血管靶向磁共振成像研究.pdf

1、目的： αvβ3整合素受體過表達于腫瘤血管內皮細胞，在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，可被視為腫瘤特異性標記物。通過對該受體的特異性標記，有望早期、特異性診斷腫瘤。本研究合成表面連接RGD短肽序列為親和成分的靶向性超順磁性長循環(huán)脂質體，并通過體外細胞學實驗、體內MRI成像確定其受體靶向性，探討早期腫瘤血管靶向性診斷的可能性。 材料與方法： 我們采用薄膜法分別合成表面連接和不連接RGD的靶向性和非靶向性長循環(huán)脂質體，其

2、內水相分別包裹超順磁性氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)和鈣黃綠素。測量其包封率、粒徑大小、弛預率，透射電鏡觀察SPIO包封情況。 靶向性研究部分采用流式細胞分析及共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)培養(yǎng)及傳代，制備細胞懸液備用。將細胞分為四組：一組加入靶向性長循環(huán)熒光脂質體(實驗組

3、)；一組加入非靶向性長循環(huán)熒光脂質體(對照組)；空白對照組僅加入PBS緩沖液；競爭實驗部分，先給予過量RGD(約10倍濃度)，然后加入靶向性長循環(huán)脂質體。反應約1小時后，用流式細胞儀測量陽性細胞百分比、幾何平均熒光強度等。 共聚焦激光掃描顯微鏡實驗部分。HUVEC置于預先放有蓋玻片的六孔細胞培養(yǎng)皿中過夜，細胞爬片備用。載有細胞的蓋玻片分別與靶向性、非靶向性長循環(huán)熒光脂質體反應約1小時，反應分別在4℃、37℃下進行。反應結束后，經

4、洗滌、固定后，共聚焦顯微鏡觀察細胞熒光標記情況。 所有實驗過程中注意避光。 隨后進行兔Vx2腫瘤模型體內MRI成像研究。于雙側兔后腿皮下建立荷瘤模型，分別經耳緣靜脈注入靶向性超順磁性長循環(huán)脂質體、非靶向性超順磁性長循環(huán)脂質體，鐵含量約3mg/kg。進行MRI掃描，測量給藥前、給藥后不同時間段腫瘤及周邊肌肉信號變化情況，計算對比噪聲比。實驗結束后處死動物，腫瘤標本進行HE、普魯士藍染色，光鏡觀察，確定靶向性造影劑中鐵的分布

5、與腫瘤血管的關系。 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差的形式表示，行單因素方差分析，以p≦0.05為有統(tǒng)計學意義。p≦0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。 結果： 靶向性超順磁性長循環(huán)脂質體、非靶向性超順磁性長循環(huán)脂質體的粒徑分別為144、147nm，兩者粒徑分布均勻。靶向性脂質體的磁性粒子包封率為0.27mg/mL，普通長循環(huán)脂質體為0.28mg/mL。RGD短肽與脂質體的偶連率為74.97％。靶向性脂質體的弛預率為1769 mM

6、—1s—1，非靶向脂質體的弛預率為1356 mM—1s—1。超順磁性長循環(huán)脂質體可以顯著縮短質子的T2弛預時間(P<0.001)。透射電鏡證實鐵顆粒包封在脂質體內。 流式細胞研究結果表明靶向組、非靶向組、競爭組及空白對照組細胞陽性率平均分別為76.15％、10.81％、18.96％及0.37％，靶向組明顯高于其他各組(P≦0.002)。幾何均數(shù)熒光強度靶向組(128.71)也遠高于非靶向組(36.71)及競爭實驗組(39.78)

7、(P<0.001)。競爭實驗組細胞陽性率、熒光強度與非靶向組接近。共聚焦研究靶向組可見明顯細胞染色，4℃時熒光染色位于細胞膜，37℃熒光染色主要位于細胞質。非靶向組細胞在4℃、37℃均未見明顯染色。 體內MRI成像顯示靶向組于腫瘤周邊及血管周邊可見信號減低，信號改變發(fā)生較慢，15小時后信號降至最低(P<0.05)，隨后開始升高；非靶向組給藥后很快出現(xiàn)信號減低，至2小時降至最低(P<0.05)，隨后信號開始逐漸升高。腫瘤對比噪聲比