環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術檢測幃類中副溶血弧菌的研究.pdf

1、副溶血性弧菌是我國一種重要的食源性病原菌,可引起急性腸胃炎,少數(shù)情況還能引發(fā)敗血病,危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成為我國一個嚴重的食源性公共衛(wèi)生問題之一,該菌引發(fā)的疾病居微生物性食源性疾病暴發(fā)之首,目前發(fā)病人數(shù)呈顯著上升趨勢。特別在沿海地區(qū),發(fā)病起數(shù)和涉及人數(shù)較我國其它地區(qū)更為嚴重,因此,必須建立可靠的快速檢測方法,持續(xù)地進行水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的主動監(jiān)測和污染控制。目前對副溶血性弧菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定方法,免疫學方法

2、和分子生物學檢測方法等。傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣,檢測時間長,而且靈敏度較低；免疫學方法的特異性和靈敏度也不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂貴的儀器設備、繁瑣的電泳過程,而使其難以在基層普及和推廣。2000年,Notomi等開發(fā)出一種新的核酸擴增技術,環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP),該技術以其靈敏度高、特異性強、快速、操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點在病毒、真菌

3、、細菌以及轉(zhuǎn)基因食品的檢測中得到應用。因此,建立LAMP技術檢測副溶血弧菌對于控制副溶血弧菌的食物中毒具有重要意義。
　　 本文以副溶血弧菌具有種特異性的gyrB基因為靶基因(基因號AY527390),應用在線引物設計軟件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)設計LAMP引物建立環(huán)介導等溫擴增方法檢測貝肉中的副溶血弧菌。對反應時間、反應溫度、鎂離子濃度等擴增條件進行優(yōu)化,

4、確定25μL的LAMP反應體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6μmol／L,外引物(F3和B3)各0.2μmol／L,環(huán)引物(LF和LB)各0.8μmol／L,0.6mmol／LdNTP,2mmol／L Mg2+,2.5μL10×Bst DNA聚合酶反應緩沖液,8u的Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補足體系。LAMP反應過程是首先在65℃水浴鍋中反應40min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴5min終止

5、反應,通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應,亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實反應是否發(fā)生。本研究對13株副溶血弧菌、14株弧菌屬菌株和19株非弧菌屬菌株作對照,驗證方法特異性,結果表明,13株副溶血弧菌檢測結果為陽性,其他33株菌株為陰性。初步研究了6種從人工污染副溶血弧菌的貝肉中提取模板DNA的方法,結果表明,LAMP對制備模板DNA方法的要求不高。本研究對LAMP法快速檢測副溶血弧菌進行了研究,確定了檢測純培養(yǎng)

6、物的靈敏度,人工污染檢出限,并與普通PCR檢測方法進行了對比。結果表明:LAMP檢測副溶血弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為19CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的貝肉檢出限為87CFU／g。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報告結果,耗時2h。而對照,PCR檢測副溶血弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為1900CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的檢出限為8700 CFU／g。采用同樣方法提取DNA,從樣品處理到報告結果,耗時4 h。模擬貝肉樣品含副溶血弧菌1CFU