環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究.pdf

1、2002年國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長期影響”的一種致病菌。嬰兒配方奶粉是其最主要的傳播途徑，而且嬰兒配方奶粉中微量的阪崎腸桿菌污染(<3CFU/100g)也能導(dǎo)致感染的發(fā)生，因此檢測阪崎腸桿菌的方法是否靈敏、特異及快速至關(guān)重要。
　　 目前對阪崎腸桿菌的檢測方法主要有FDA推薦的傳統(tǒng)檢測方法，免疫學(xué)方法和PCR方法。傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣，檢測時(shí)間長，

2、而且靈敏度較低；免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度也不理想；PCR方法敏感、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程，而使其難以在基層普及和推廣。采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）技術(shù)，檢測嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測方法簡便，耗時(shí)短而且檢測成本低，能夠在基層普及和推廣。
　　 針對阪崎腸桿菌（ATCC29544）GenBank中

3、（基因號(hào)AY702093）16S-23S rRNA的保守序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物。對反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25 μL的 LAMP反應(yīng)體系為：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.2 μM，外引物（F3和B3）各0.2 μM，環(huán)引物（LF和LB）各0.6 μM,2.5 mM dNTP，1.6 M甜菜堿,

4、4 mM MgSO4，10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,8U的Bst DNA聚合酶大片段,3 μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在64℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。
　　 為了比較LAMP檢測阪崎腸桿菌靈敏度和人工污染檢出限，以 PCR方法作對照。PCR反應(yīng)的引物是改良LAMP的兩條外

5、引物（F3和B3）。結(jié)果表明，改良LAMP檢測阪崎腸桿菌的檢出限為0.101CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1.100CFU/g。采用試劑盒提取DNA，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果，耗時(shí)1h。對照PCR耗時(shí)3h，檢測阪崎腸桿菌的檢出限為101CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1100CFU/g。改良LAMP的靈敏度是PCR的1000倍。
　　 對普通LAMP和改良LAMP以及改良LAMP自身

6、加環(huán)引物和未加環(huán)引物進(jìn)行了檢測阪崎腸桿菌純培養(yǎng)和人工污染檢出限的比較，結(jié)果表明，改良LAMP的靈敏度是普通LAMP和未加環(huán)引物改良LAMP的10倍。
　　 初步研究了6種模板制備方法對LAMP檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的影響。研究表明LAMP方法對制備模板DNA的要求不高。通過對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，將本方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1632.1-2005方法進(jìn)行比較，確定LAMP方法敏感性為100％，特異性為98.15％，符合率為98.