環(huán)介導等溫核酸擴增技術(LAMP)在霍亂弧菌快速檢測中的應用與研究.pdf

1、研究目的
　　 霍亂弧菌是嚴重威脅著人們健康的重要腸道致病菌,在我國被列為甲類“2號”傳染病原菌,每年衛(wèi)生部門花費大量人力物力用于霍亂的疾病預防與病原檢測。本研究就是利用LAMP技術開發(fā)、建立快速、可靠、簡便的霍亂弧菌檢測方法,以便于在基層單位推廣使用,為霍亂疫情監(jiān)測與預防提供更為及時的應急檢測服務和參考結果。
　　 研究主要內(nèi)容和方法
　　 通過參閱文獻資料,研究LAMP的技術細節(jié)與過程,確定特異的霍亂弧菌基因

2、作為目標基因,建立基礎的LAMP反應實驗體系。通過Genbank檢索、下載霍亂弧菌基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相關核酸序列分析軟件比對分析確定具有鑒定意義的霍亂弧菌基因序列作為目標序列,使用專門的LAMP引物設計軟件PrimerExplorer v4針對目標序列設計特異的霍亂弧菌LAMP引物。以SYBR GreenⅠ作為熒光劑在熒光定量PCR儀上實時檢測LAMP反應結果,作為本研究開發(fā)、建立霍亂弧菌的LAMP快

3、速檢測方法的主要研究方式。通過優(yōu)化反應溫度、時間、組成濃度等實驗條件對LAMP檢測方法進行改進。通過與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法和PCR方法比較進行方法學評價,前者為霍亂防治手冊(衛(wèi)生部1996年)規(guī)定的常規(guī)方法,后者系以霍亂弧菌ace,rtxA和ctxA為目標基因的普通PCR方法。
　　 研究結果
　　 本研究建立的霍亂弧菌LAMP快速檢測方法以霍亂弧菌的外分泌蛋白系統(tǒng)M亞單位的編碼基因epsM和霍亂毒素A亞單位的編碼基因

4、ctxA為目標基因,前者具有良好的霍亂弧菌種特異性,后者用于檢測產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌菌株。本方法使用epsM引物和ctxA引物,從8個種屬的20株實驗菌株中分別正確地檢出所有13株霍亂弧菌菌株和所有5株產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌菌株,對菌株純培養(yǎng)物的檢出限分別達到了12.5cfu/μl(25cfu/reaction)和5cfu/μl(10cfu/reaction),明顯低于其它比較的兩種方法,尤其傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,PCR方法的檢出限分別為1

5、00cfu/reaction(rtxA)和50cfu/reaction(ctrA)。方法學評價方面,從75份實際樣品的檢測結果來看,本研究建立的LAMP方法與比較的PCR方法的霍亂弧菌檢出率沒有明顯差異(x2=0.500,P＞0.05,α2-side=0.05,Kappa=0.894.),但兩者明顯高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法(P＜0.05,α2-side=0.05)。
　　 結論
　　 與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法相比,本研