用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)檢測轉基因稻米中的CP4-EPSPS基因.pdf

1、自20世紀末轉基因作物商業(yè)化種植以來，全球轉基因作物累計種植面積已達到20億公頃。中國政府對糧食作物轉基因研發(fā)的戰(zhàn)略是保證抗蟲水稻、玉米、小麥等糧食作物轉基因的研發(fā)力度，保持轉基因水稻研發(fā)的國際領先地位。顯然，對轉基因作物檢測方法的研究不但具有重要的理論意義，也具有十分重要的應用價值。
　　環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種設備要求簡單、反應時間短、特

2、異性高、靈敏度高的DNA檢測技術。本研究以稻米中CP4-EPSPS基因為對象，建立了一種改良的基于環(huán)介導等溫擴增技術的檢測方法。在傳統(tǒng)LAMP方法基礎上，在擴增后的體系中加入SYBR GreenⅠ染料或在擴增體系中內摻入離子型染料HNB，使陽性檢驗結果發(fā)生顏色變化，實現(xiàn)了檢測結果的肉眼直接判讀。內摻HNB染料不影響擴增，可以有效地避免因開蓋形成氣溶膠污染實驗室，造成后續(xù)結果假陽性率高的問題。為縮短檢測的時間，本研究試驗了用FTA卡提取水

3、稻基因組DNA的方法，將提取時間縮短到20分鐘，且不需要冷凍離心設備，實現(xiàn)了基因組DNA的現(xiàn)場快速提取。FTA卡提取水稻基因組DNA與LAMP相結合可以大大節(jié)省檢測時間。
　　本研究對LAMP反應體系進行了優(yōu)化，試驗的Mg2+終濃度為2mM、4mM、6mM、8mM、10mM和12mM，試驗的dNTP濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM。以野生型粳稻受體品種TP309、轉CP4-EPSPS基因水稻

4、、轉PMI基因水稻、轉NPTⅡ基因水稻、轉GUS基因水稻、轉HPT基因水稻的基因組DNA為模板，通過外加SYBR GreenⅠ染料或內摻HNB染料，對LAMP擴增體系進行試驗，篩選確定了特異性引物。用TP309水稻種子基因組10倍梯度稀釋轉CP4-EPSPS基因的水稻基因組DNA，試驗的轉基因成分濃度為單粒水稻種子基因組DNA的10-3、10-4、10-5和10-6，以各個稀釋濃度基因組為模板，通過外加SYBR GreenⅠ染料或內摻H

5、NB染料，對LAMP擴增體系進行試驗，確定了LAMP方法的檢出下限。優(yōu)化后的外加SYBR GreenⅠ染料的反應條件為:Mg2+濃度4mM、dNTP濃度0.4mM，優(yōu)化后的內摻HNB染料反應條件為:Mg2+濃度4mM、dNTP濃度0.6mM，擴增條件均為60℃反應60min，擴增結束后85℃變性10min。以野生型水稻TP309、轉PMI基因水稻、轉NPTⅡ基因水稻、轉GUS基因水稻、轉HPT基因水稻為模板進行試驗，確定該反應體系能夠特

6、異性地擴增目的基因，將單粒水稻種子基因組10倍梯度稀釋，確定反應檢出下限為單粒水稻種子基因組DNA的10-5。
　　本研究還比較了外加SYBR GreenⅠ染料或內摻HNB染料的LAMP方法的假陽性率，連續(xù)三天檢測樣品，確定內摻HNB染料的方法假陽性率為零，而外加SYBRGreenⅠ染料會出現(xiàn)假陽性結果。本研究推薦的用FTA卡提取水稻種子基因組DNA偶聯(lián)LAMP的體系，使操作更為簡便，可以滿足現(xiàn)場快檢要求，為大批量樣品的快速檢測奠