(一)以苯丙氨酰-tRNA合成酶為靶點的新型抗結核藥物高通量篩選模型的建立和應用(二)可可西里堿性土壤樣品細菌的分離和嗜堿菌株的多相分類研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病。近年來,曾被有效控制的結核病大有卷土重來之勢,其重要原因就是對于傳統(tǒng)一線抗結核藥物的多重耐藥菌的急劇出現(xiàn)。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)新型低毒、高效抗結核分枝桿菌藥物。
　　 氨酰-tRNA合成酶在蛋白質的生物合成過程中起了至關重要的作用,它催化氨基酸與相應的tRNA合成氨酰-tRNA。對于病原菌而言,一旦它的某種

2、氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能,就會導致其蛋白質的生物合成中斷以及許多重要的生理過程受影響,那么病原菌在體外或是在宿主體內的生長繁殖也就隨之終止。目前,氨酰-tRNA合成酶已成為開發(fā)抗結核藥物的理想靶點之一。
　　 本研究以結核分枝桿菌生長所必須的且與其宿主中相關酶有著較大差異的苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)作為新型抗結核藥物的篩選靶點。在本實驗中,我們首先從結核分枝桿菌基因組中擴增出 pheRS基因(包括pheS

3、和pheT基因),利用構建的原核表達系統(tǒng)pET30a-pheST在大腸桿菌中成功表達了PheRS蛋白,采用NADH比色法檢測酶活性的方法建立了酶水平的PheRS抑制劑高通量初篩模型。并以此模型篩選了化合物樣品11600個,發(fā)酵液樣品5200個,篩選得到陽性化合物9個,陽性發(fā)酵液37個。
　　 隨后,通過恥垢分枝桿菌作為檢定菌的抗菌活性測定及細胞毒性評價后,得到了6個在酶水平和抗分枝桿菌方面均具有良好活性且毒性較低的發(fā)酵液陽性樣品

4、。同時,初步結果還表明109FA-00484和109FA-00494對結核分枝桿菌的PheRS抑制活性呈現(xiàn)出一定的量效關系,且對人的重組PheR抑制作用較弱,呈現(xiàn)出良好的選擇性毒性。
　　 由于該酶在細菌中是普遍存在的,而且其序列相對比較保守,本研究還檢測了陽性發(fā)酵液樣品對其它革蘭氏陽性和陰性病原菌的抗菌活性,結果表明陽性發(fā)酵液樣品109FA-00484和109FA-00494對多種耐藥G+細菌如MRSA、MRSE等具有較好的抗

5、菌活性,其中109FA-00484樣品還VRE、對產超廣譜β-內酰胺(ESBLs)酶的肺炎克雷伯氏菌和綠膿桿菌表現(xiàn)出一定抑制作用。陽性發(fā)酵液樣品I10AB-00631對所測所有的G+病原菌敏感菌株及其耐藥株均有一定抑制作用,I10AA-00733對所測15株病原菌均沒有體現(xiàn)抗菌活性,但是對分枝桿菌具有較好的選擇性抗菌活性。
　　 綜上所述,通過酶水平篩選、抗菌活性及毒性評價后,本研究得到了4株候選菌株I09FA-00484、I0