(一)以苯丙氨酰-tRNA合成酶為靶點(diǎn)的新型抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用(二)可可西里堿性土壤樣品細(xì)菌的分離和嗜堿菌株的多相分類研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。近年來(lái),曾被有效控制的結(jié)核病大有卷土重來(lái)之勢(shì),其重要原因就是對(duì)于傳統(tǒng)一線抗結(jié)核藥物的多重耐藥菌的急劇出現(xiàn)。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)新型低毒、高效抗結(jié)核分枝桿菌藥物。
　　 氨酰-tRNA合成酶在蛋白質(zhì)的生物合成過程中起了至關(guān)重要的作用,它催化氨基酸與相應(yīng)的tRNA合成氨酰-tRNA。對(duì)于病原菌而言,一旦它的某種

2、氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能,就會(huì)導(dǎo)致其蛋白質(zhì)的生物合成中斷以及許多重要的生理過程受影響,那么病原菌在體外或是在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖也就隨之終止。目前,氨酰-tRNA合成酶已成為開發(fā)抗結(jié)核藥物的理想靶點(diǎn)之一。
　　 本研究以結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)所必須的且與其宿主中相關(guān)酶有著較大差異的苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)作為新型抗結(jié)核藥物的篩選靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們首先從結(jié)核分枝桿菌基因組中擴(kuò)增出 pheRS基因(包括pheS

3、和pheT基因),利用構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)pET30a-pheST在大腸桿菌中成功表達(dá)了PheRS蛋白,采用NADH比色法檢測(cè)酶活性的方法建立了酶水平的PheRS抑制劑高通量初篩模型。并以此模型篩選了化合物樣品11600個(gè),發(fā)酵液樣品5200個(gè),篩選得到陽(yáng)性化合物9個(gè),陽(yáng)性發(fā)酵液37個(gè)。
　　 隨后,通過恥垢分枝桿菌作為檢定菌的抗菌活性測(cè)定及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)后,得到了6個(gè)在酶水平和抗分枝桿菌方面均具有良好活性且毒性較低的發(fā)酵液陽(yáng)性樣品

4、。同時(shí),初步結(jié)果還表明109FA-00484和109FA-00494對(duì)結(jié)核分枝桿菌的PheRS抑制活性呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,且對(duì)人的重組PheR抑制作用較弱,呈現(xiàn)出良好的選擇性毒性。
　　 由于該酶在細(xì)菌中是普遍存在的,而且其序列相對(duì)比較保守,本研究還檢測(cè)了陽(yáng)性發(fā)酵液樣品對(duì)其它革蘭氏陽(yáng)性和陰性病原菌的抗菌活性,結(jié)果表明陽(yáng)性發(fā)酵液樣品109FA-00484和109FA-00494對(duì)多種耐藥G+細(xì)菌如MRSA、MRSE等具有較好的抗

5、菌活性,其中109FA-00484樣品還VRE、對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺(ESBLs)酶的肺炎克雷伯氏菌和綠膿桿菌表現(xiàn)出一定抑制作用。陽(yáng)性發(fā)酵液樣品I10AB-00631對(duì)所測(cè)所有的G+病原菌敏感菌株及其耐藥株均有一定抑制作用,I10AA-00733對(duì)所測(cè)15株病原菌均沒有體現(xiàn)抗菌活性,但是對(duì)分枝桿菌具有較好的選擇性抗菌活性。
　　 綜上所述,通過酶水平篩選、抗菌活性及毒性評(píng)價(jià)后,本研究得到了4株候選菌株I09FA-00484、I0