Hedgehog信號通路和EMT相關因子在黑色素瘤細胞中表達及其意義.pdf

1、目的:
　　研究Hedgehog（Hh）信號轉(zhuǎn)導通路相關因子和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）相關因子在B16黑色素瘤細胞中的表達及兩者交互調(diào)節(jié)關系。
　　方法:
　　本研究用Hh信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑-環(huán)巴胺（Cyclopamine）處理小鼠黑色素瘤B16細胞，采用MTT法與軟瓊脂集落形成實驗來檢測細胞抑制率和克隆形成能力，用RT-PCR法和Wester

2、n-Blot方法檢測 Hh信號轉(zhuǎn)導通路和EMT相關因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。
　　結(jié)果:
　　MTT結(jié)果顯示：cyclopamine對B16細胞有抑制作用，且具有濃度依賴性。軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示Cyclopamine藥物組對細胞的抑制率有明顯的影響，且隨著藥物濃度的增加對細胞的抑制率增高。20μM組與0、2.5、5μM組相比，有顯著性差異（p<0.05）,40、80μM組與20μM組比較，有顯著性差異（p<0.0

3、5）。但是，40μM與80μM組相比，沒有統(tǒng)計學意義（p=0.109）。
　　軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示：B16黑色素瘤細胞在20μM Cyclopamine藥物組和10μM Cyclopamine藥物組軟瓊脂中所形成的集落個數(shù)少于對照組軟瓊脂中的集落個數(shù)與5μM Cyclopamine藥物組，且具有顯著性差異(p<0.05)；而在5μM Cyclopamine藥物組軟瓊脂中所形成的集落個數(shù)與對照組軟瓊脂中的集落個數(shù)無統(tǒng)計學差異(

4、p>0.05)。且隨著藥物濃度的增高，B16黑色素瘤細胞所形成的集落個數(shù)降低。
　　RT-PCR24h結(jié)果顯示：ihh mRNA在給予20μM cyclopamine藥物組和5μM cyclopamine藥物組的表達低于對照組。ptch mRNA在各藥物組中的表達低于在對照組中的表達，而在20μM cyclopamine藥物組的表達低于5μM cyclopamine藥物組。twist mRNA在各藥物組的表達低于對照組。vimen

5、tin mRNA在給予5μM cyclopamine藥物組的表達高于20μM cyclopamine藥物組。slug mRNA在各藥物組表達低于對照組。e-cadherin mRNA在5μM cyclopamine藥物組中的表達低于對照組，在20μM cyclopamine藥物組中明顯低于對照組的表達。48h結(jié)果顯示：ihh mRNA在給予cyclopamine藥物組中的表達低于對照組。smo mRNA在20μM cyclopamine

6、藥物組的表達高于5μM cyclopamine藥物組和對照組。gli1 mRNA在20μM cyclopamine藥物組中的表達低于其他藥物組和對照組。vimentin mRNA在20μM cyclopamine藥物組的表達高于其他藥物組和對照組。slug mRNA在20μM cyclopamine的藥物組中的表達高于其他藥物組和對照組。e-cadherin mRNA在20μM cyclopamine藥物組的表達高于5μM cyclop

7、amine藥物組和對照組。72h結(jié)果顯示：ihh mRNA在cyclopamine各藥物組中的表達均低于對照組。ptch mRNA在cyclopamine藥物組的表達低于對照組，且20μM cyclopamine的藥物組中的表達低于5μM cyclopamine藥物組。smo mRNA在20μM cyclopamine藥物組中和5μM cyclopamine藥物組的表達低于對照組。vimentin mRNA在20μM cyclopami

8、ne的藥物組中的表達低于5μM cyclopamine藥物組和對照組。slug在20μM cyclopamine藥物組中的表達低于對照組。
　　Western-Blot24h結(jié)果顯示：gli1蛋白在各組之間無顯著性差異。48h結(jié)果顯示gli1蛋白在對照組中的表達高于20μM cyclopamine藥物組和5μM cyclopamine藥物組。
　　結(jié)論:
　　1. Cyclopamine對黑色素瘤B16細胞的生長有明顯

9、抑制作用。
　　2. gli1在中期（48h）的蛋白和mRNA的表達均明顯下降。提示Cyclopamine抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路的第二信使作用。
　　3. Cyclopamine早期(24h)對黑色素瘤B16細胞ihh與ptch的表達有明顯抑制作用，進而抑制 Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路。其作用機制主要是通過抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)導通路的信號啟動環(huán)節(jié)與信號接收環(huán)節(jié)的終止來發(fā)生。
　　4. Cyclopam