嘌呤受體P2Y2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對肝細(xì)胞癌的細(xì)胞行為的影響.pdf

1、目的：P2Y2作為嘌呤受體家族的一員介導(dǎo)多種生物功能，其中包括有絲分裂，血管生成，趨化，細(xì)胞增殖和遷移和炎癥等。P2Y2受體表達(dá)廣泛，包括正常及病變組織，在人類的肝細(xì)胞中也有表達(dá)，然而在P2Y2受體在肝癌(HCC)的作用尚不清楚。因此，本課題旨在研究嘌呤受體P2Y2在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的表達(dá)及其對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控，從而介導(dǎo)對肝癌細(xì)胞增殖，遷移的作用機(jī)制。
　　 方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、Western-Bolt

2、技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測并比較正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系、正常肝組織和肝癌組織中P2Y2、P2Y4受體mRNA及蛋白含量的表達(dá)。共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察P2Y受體家族特異性激動劑ATP(10um/L)、P2Y4受體特異性的激動劑ADP(10um/L)、P2Y2受體特異性激動劑UTP(10um/L)和各鈣通道相應(yīng)阻斷劑suramin(P2Y2受體特異性阻斷劑10um/L)、2-APB(30um/L)、LaCl3(30um/L)、SKF(10um

3、/L)(SOC型鈣通道特異性阻斷劑)，Nifedipine(VGCC型鈣通道特異性阻斷劑30um/L)，U73122(PLC途徑特異性阻斷劑5um/L)對肝癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察不同途徑調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化對癌細(xì)胞增殖，遷移的影響，并通過RNAi技術(shù)進(jìn)一步證明功能實(shí)驗(yàn)及阻斷劑結(jié)果。將培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2接種在裸鼠腋下建立肝癌裸鼠腫瘤模型，一周后成瘤，將成瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，對照組

4、(0.1ml)、模型組A(ATP，10mg/kg)、模型組B(suramin，10mg/kg)、模型組C(2-APB，10mg/kg)，每天給藥一次，瘤內(nèi)注射。分別于藥物注射的10、15、20、25、30天處死裸鼠并比較對照組與各給藥組之間腫瘤的生長情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)P2Y2受體在正常肝細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞系，正常肝組織、肝癌組織均有表達(dá)，但肝癌細(xì)胞較正常肝細(xì)胞P2Y2受體的蛋白及mRNA表達(dá)均明顯增高(P<

5、0.05)，肝癌組織較正常肝組織P2Y2受體蛋白表達(dá)上調(diào)，但mRNA結(jié)果無明顯差異。P2Y4受體在肝癌、正常肝組織，正常肝細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系雖表達(dá)但均無明顯差異(P>0.05)。
　　 (2)經(jīng)激動劑ATP或UTP刺激后，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+均瞬時(shí)大幅度升高，但肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞升高的幅度更大(P<0.05)，且ATP升高的幅度較UTP略高，ADP刺激后細(xì)胞內(nèi)Ca2+無明顯變化(P>0.05)；給予阻斷劑suram

6、in、U73122作用后，肝癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高部分受到抑制(P<0.01)，阻斷劑2-APB、Lacl3、SKF能完全抑制由ATP誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高(P<0.01)；Nifedipine對細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高無作用。在無外Ca2+的條件下，2-APB能部分阻斷ATP刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高(P<0.05)，Lacl3、SKF無阻斷作用(P>0.05)。當(dāng)細(xì)胞從無Ca2+環(huán)境轉(zhuǎn)換到有Ca2+環(huán)境時(shí)(Ca2+2mM)，再次

7、刺激，2-APB、Lacl3、SKF卻能完全阻斷由該刺激引起的內(nèi)Ca2+升高(P<0.05)。
　　 (3)RNAi實(shí)驗(yàn)：通過轉(zhuǎn)染使P2Y2基因沉默后，共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Ca2+離子的變化和上述加入阻斷劑后的效果相同。
　　 (4)低劑量的ATP及UTP對肝癌細(xì)胞有促增殖及遷移作用(P<0.05)，并呈濃度時(shí)間依賴性，而ADP無明顯作用；阻斷劑suarmin和2-APB作用后均能明顯抑制ATPU誘導(dǎo)的增殖及遷移(P

8、<0.01)。
　　 (5)裸鼠實(shí)驗(yàn)：在給藥10天后，與生理鹽水組比較，ATP組、uramin組、2-APB組腫瘤體積大小無明顯差異，給藥第15天ATP組腫瘤的體積稍有增大但仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，至第20天時(shí)ATP組體積明顯增大并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而阻斷劑suramin組及2-APB組在第15天時(shí)較生理鹽水組體積即有減小趨勢(P<0.05)。后上述差異隨時(shí)間逐漸明顯，30天時(shí)ATP組較生理鹽水組腫瘤體積明顯

9、增大(P<0.01)，兩阻斷劑組腫瘤體積均明顯減小(P<0.01)，且2-APB的阻斷效果較suramin的效果更明顯。
　　 結(jié)論：
　　 (1)正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2，正常肝組織及肝癌組織中均存在P2Y2、P2Y4受體的表達(dá)，且在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中P2Y2蛋白的表達(dá)增多，而P2Y4無明顯變化。
　　 (2)ATP刺激引起HepG2細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高主要是由P2Y受體家族中的P2Y2受體所引起的