Mig-6表達(dá)缺失與非小細(xì)胞肺癌惡性演進(jìn)的關(guān)系及對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響和調(diào)控機(jī)制.pdf

1、前言：
　　肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，約占惡性腫瘤致死率的30％。肺癌中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占85％，其中主要包含兩種組織學(xué)類(lèi)型:腺癌和鱗癌。肺癌的防治是全世界共同面對(duì)的一項(xiàng)難題，盡管針對(duì)肺癌的外科手術(shù)、化療和放療的已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但療效依舊不理想，五年生存率很低。
　　絲裂原誘導(dǎo)基因6（mitogen-inducible gene-6，Mi

2、g-6）最早是在對(duì)細(xì)胞周期的研究中發(fā)現(xiàn)的。Mig-6是一種早期反應(yīng)基因，可受多種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)，例如生長(zhǎng)因子、低氧狀態(tài)和壓力信號(hào)等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它在人體分布廣泛，可以負(fù)向調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)下游靶基因的活化，在小鼠模型中，下調(diào)Mig-6的表達(dá)，可引起肺、膀胱、膽管以及消化道的腫瘤發(fā)生，提示Mig-6并可能與多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。進(jìn)一步研究提示，Mig-6在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，提示其可能扮演著抑癌基因的角色。
　

3、　但是，Mig-6在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系尚不明確，Mig-6的變化對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響也未有研究。為了明確以上問(wèn)題，我們檢測(cè)了NSCLC中Mig-6的表達(dá)情況，分析了Mig-6表達(dá)與臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步探討了Mig-6對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1、組織標(biāo)本來(lái)源
　　本研究獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，150例肺癌組織及20例癌旁正常肺組織（距

4、原發(fā)腫瘤邊界5cm以上）收集自2007-2012年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)的病人，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。這些患者在手術(shù)前均未接受放化療，并已知情其切除組織用于診斷后剩余部分會(huì)被保存及用于科學(xué)研究，其醫(yī)療記錄會(huì)被用于后續(xù)隨訪，但隱私會(huì)被嚴(yán)格保密。腫瘤的組織學(xué)診斷、分化程度和分期通過(guò)伊紅蘇木素染色后根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第七版）進(jìn)行判定。150例肺癌標(biāo)本中，鱗癌69例，腺癌81例

5、，伴發(fā)淋巴結(jié)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移60例。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　肺癌細(xì)胞系H1299，A549和H157細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式菌種收藏所，BE1細(xì)胞系由北京大學(xué)鄭杰教授惠贈(zèng)。細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基含10％的滅活小牛血清培養(yǎng)，并于實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)傳代至六孔板中。Mig-6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-Mig-6和對(duì)照空載體pc-DNA3均為商業(yè)化質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑為Attractene。Mig-6特異性siRNA和對(duì)照亂序siRNA購(gòu)自

6、GenePharma。siRNA轉(zhuǎn)染試劑為DharmaFECT1。mRNA和蛋白檢測(cè)均在轉(zhuǎn)染或干擾后48小時(shí)進(jìn)行。
　　3、免疫組織化學(xué)染色
　　組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。將石蠟包埋的肺癌組織塊切成4μm厚切片，癌旁的正常支氣管上皮作為陰性對(duì)照。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。使用即用型非生物素免疫組化EliVisionTM plus檢測(cè)試劑盒（邁新，福州，中國(guó)）及Mig-6多克隆抗體(1∶100)進(jìn)行免疫組化染

7、色。兩位病理醫(yī)生對(duì)切片分別作出判定，每張組織切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野共計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，陽(yáng)性率根據(jù)陽(yáng)性癌細(xì)胞所占百分比計(jì)算。Mig-6表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，也可在細(xì)胞核中表達(dá)。免疫組化結(jié)果評(píng)判方法參考本研究課題組前期文獻(xiàn)報(bào)道，每個(gè)病例的Mig-6的陽(yáng)性率1％～25％為1分、＞25％～50％為2分、＞50％為3分，染色強(qiáng)度分為0分（無(wú)著色）、1分（弱）、2分（強(qiáng)）。陽(yáng)性率與強(qiáng)度評(píng)分相乘:當(dāng)＞10％的癌細(xì)胞染色陽(yáng)性時(shí)則

8、該病例定義為表達(dá)陽(yáng)性，＜3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。
　　4、免疫蛋白印跡
　　使用蛋白裂解液從細(xì)胞系中提取總蛋白并使用Bradford法定量分析。使用濃度為12％的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)60mg蛋白進(jìn)行分離，并將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上后在4℃使用下列抗體過(guò)夜孵育:抗Mig-6(1∶2000)，抗β-actin(1∶500)，抗bcl-2(1∶500)和抗磷酸化ERK(1∶2000)。相對(duì)蛋白表達(dá)水平以

9、β-actin作為加樣對(duì)照進(jìn)行計(jì)算。
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR（SYBR Green法）
　　對(duì)于新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞采用RNeasy plus Mini kit提取總RNA。使用SYBRGreen PCR master mix(Applied Biosystems)進(jìn)行定量real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20μl。使用7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀過(guò)程如下:95℃，30秒;95℃，5秒，40個(gè)循環(huán);60℃，30秒。引

10、物序列見(jiàn)（表1）.β-actin作為內(nèi)參.基因相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算方式如下△Ct=Ct gene-Ct reference，增加倍數(shù)用如2-△△Ct方法計(jì)算，每次試驗(yàn)均做三個(gè)重復(fù)孔。
　　6、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　運(yùn)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒，收集細(xì)胞后經(jīng)冷PBS沖洗后使用結(jié)合緩沖液懸浮，并調(diào)整細(xì)胞密度至2-5×105/ml，于暗室中在195ul體系中加入5μlAnnexinⅤ-FITC室溫孵育10分鐘后加入190

11、μl結(jié)合緩沖液(1×)和10μl PI。使用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并使用CellQuest分析軟件分析數(shù)據(jù)。
　　7、統(tǒng)計(jì)分析
　　各組資料利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析Mig-6表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;運(yùn)用Kaplan-Meier和Log-rank生存分析患者預(yù)后并行組間比較;運(yùn)用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。P值小于0.05提示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、Mig

12、-6蛋白表達(dá)的臨床意義。
　　我們用免疫組化的方法檢測(cè)了150例非小細(xì)胞肺癌及其癌旁正常組織中Mig-6蛋白表達(dá)情況。Mig-6主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)。在正常支氣管上皮中Mig-6表現(xiàn)出胞漿和胞核的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞中Mig-6的蛋白表達(dá)下調(diào)。我們又分析了Mig-6的表達(dá)和臨床病理因素之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Mig-6的表達(dá)缺失和高TNM分期(Ⅰ+Ⅱ vs.Ⅲ+Ⅳ，p=0.014)、低組織分化（高vs.中低，p=0.002）以及鱗

13、癌（鱗癌vs.腺癌，p=0.005）存在關(guān)系，與其他諸如性別、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
　　2、Mig-6的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系
　　Kaplan-Meier生存分析表明，與Mig-6陽(yáng)性表達(dá)的患者(n=26)相比，Mig-6陰性表達(dá)患者(n=34)的平均生存時(shí)間顯著縮短(45±11.132月vs.13±1.458月)。回歸分析（Cox模型）顯示TNM分期和Mig-6的表達(dá)同為影響肺癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素（p值分別為0.00

14、0和0.005）。
　　3、通過(guò)Mig-6特異性siRNA干擾和轉(zhuǎn)染表達(dá)Mig-6的質(zhì)粒雙向調(diào)控肺癌細(xì)胞系中Mig-6的表達(dá)
　　根據(jù)本研究課題組前期文獻(xiàn)報(bào)道，Mig-6在H1299和BE1細(xì)胞中高表達(dá)，而在A549和H157細(xì)胞中低表達(dá)。在H1299和BE1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Mig-6特異性siRNA，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)運(yùn)用western blot法和實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)Mig-6在H1299和BE1細(xì)胞系中蛋白和mRNA表達(dá)水平均明

15、顯下調(diào)。在A549和H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)Mig-6的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)運(yùn)用western blot法和實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)Mig-6在A549和H157細(xì)胞系中蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高。
　　4、Mig-6對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響
　　在H1299和BE1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Mig-6特異性siRNA，運(yùn)用western blot法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)顯示Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡受到抑制（H1

16、299對(duì)照vs.Mig-6 siRNA:11.54±0.65 vs.6.10±1.29％，p＜0.01;BE1對(duì)照vs.Mig-6 siRNA:12.63±0.96 vs.6.42±0.83％，p＜0.01）。在A549和H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)Mig-6的質(zhì)粒，運(yùn)用western blot法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)顯示Bcl-2蛋白表達(dá)水平受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率明顯升高（A549空載體vs.Mig-6質(zhì)粒:7.05±0.

17、82 vs.13.98±0.79％，p＜0.01;H157空載體vs.Mig-6質(zhì)粒:12.46±0.87vs.17.35±1.44％, p＜0.05)。
　　5、Mig-6通過(guò)ERK調(diào)控Bcl-2表達(dá)和細(xì)胞凋亡
　　在H1299和BE1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Mig-6特異性siRNA，并用ERK特異性抑制劑PD98059預(yù)處理或共轉(zhuǎn)染ERK特異性siRNA，運(yùn)用western blot法檢測(cè)ERK、pERK和Bcl-2蛋白的表達(dá)，運(yùn)

18、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:抑制ERK活化可逆轉(zhuǎn)Mig-6表達(dá)缺失導(dǎo)致的Bcl-2表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制。在A549和H157細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)Mig-6的質(zhì)粒，并用ERK特異性抑制劑PD98059預(yù)處理，運(yùn)用westernblot法檢測(cè)pERK和Bcl-2蛋白的表達(dá)，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與過(guò)表達(dá)Mig-6的效果一致，可下調(diào)Bcl-2的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　

19、1、Mig-6表達(dá)缺失與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)分型（鱗癌）、低分化和高TNM分期相關(guān)，與患者的性別、年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
　　2、Mig-6表達(dá)缺失與患者的不良預(yù)后相關(guān)，是獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素。
　　3、Mig-6抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。
　　4、Mig-6表達(dá)缺失可上調(diào)Bcl-2并抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。
　　5、Mig-6對(duì)肺癌的惡性演進(jìn)具有負(fù)向調(diào)控能力，發(fā)揮著抑癌基因