基于CHO DG44細(xì)胞的穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株篩選系統(tǒng)的初步建立.pdf

1、目前單克隆抗體(mAbs)已經(jīng)成為世界生物工程制藥業(yè)的支柱產(chǎn)品。能夠大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體的一個(gè)重要前提是獲得穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株，然而篩選持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的重組細(xì)胞株是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程。研究者需要不斷優(yōu)化表達(dá)載體和細(xì)胞株篩選方式。本實(shí)驗(yàn)室已研制出的流感病毒、肝炎病毒中和抗體需要大量的抗體用于臨床前研究，因此需要建立一個(gè)高產(chǎn)、穩(wěn)定的細(xì)胞株表達(dá)平臺(tái)。本研究以乙肝嵌合抗體E6F6cAb為模式蛋白，以CHO DG44(dhfr-)作為宿主細(xì)胞，構(gòu)建

2、嵌合抗體E6F6cAb穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株，從而建立起穩(wěn)定細(xì)胞株篩選系統(tǒng)，包括質(zhì)粒構(gòu)建、潮霉素加壓篩選、MTX加壓誘導(dǎo)基因擴(kuò)增、細(xì)胞克隆化（單克隆有限稀釋法、流式分選法）、細(xì)胞株產(chǎn)能評(píng)價(jià)和穩(wěn)定性評(píng)估、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)工藝等環(huán)節(jié)。高產(chǎn)細(xì)胞株的獲得，使得單克隆抗體的大量表達(dá)成為可能，為以后的抗體藥物表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以CHO DG44(dhfr-)為宿主細(xì)胞系，共轉(zhuǎn)染優(yōu)化后的質(zhì)粒pCWLK和pCH，利用質(zhì)粒中潮霉素抗性進(jìn)

3、行首次篩選并將存活細(xì)胞克隆化，獲得初始細(xì)胞株。為了進(jìn)一步提高細(xì)胞株產(chǎn)量，我們挑選6個(gè)表達(dá)抗體最高的初始細(xì)胞株，分別用MTX進(jìn)行加壓，使抗體基因擴(kuò)增。初始細(xì)胞株(1-48，1-63)經(jīng)幾輪MTX加壓篩選后，抗體產(chǎn)量均有明顯的提高。接下來將這2個(gè)初始細(xì)胞株經(jīng)MTX篩選得到的細(xì)胞群體單克隆化，并對(duì)其中20個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行表達(dá)水平鑒定，結(jié)果表明抗體表達(dá)量最高為43mg/L。我們挑選4個(gè)表達(dá)量較高的細(xì)胞株進(jìn)行長期培養(yǎng)和穩(wěn)定性研究。經(jīng)過60天的長

4、期培養(yǎng)及產(chǎn)量檢測(cè)我們確定這4個(gè)單克隆細(xì)胞株均能長期穩(wěn)定表達(dá)E6F6cAb抗體。
　　 為了進(jìn)一步提高高產(chǎn)細(xì)胞株篩選的效率，本研究還對(duì)單克隆篩選方法進(jìn)行改進(jìn)，嘗試采用流式分選和有限稀釋法相結(jié)合的方法篩選細(xì)胞株。從經(jīng)MTX加壓后的1-63細(xì)胞群體得到256個(gè)單克隆細(xì)胞株，細(xì)胞單產(chǎn)量為5-25 pg/c/d,細(xì)胞株抗體表達(dá)量最高達(dá)到140mg/L。
　　 為了提高抗體的產(chǎn)量，本研究以單克隆細(xì)胞株1-63-10G11(43mg/

5、L)為模式細(xì)胞株，摸索細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)工藝的初步優(yōu)化。從實(shí)驗(yàn)室原有培養(yǎng)基庫中篩選得到培養(yǎng)基DG44-32，并以其脫鹽濃縮液作為補(bǔ)料培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞株的流加培養(yǎng)。同時(shí)以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)基礎(chǔ)與補(bǔ)料培養(yǎng)基中氨基酸Asn、Asp、Glu與Gln濃度分別進(jìn)行調(diào)整，使批培養(yǎng)最大活細(xì)胞密度達(dá)到5×106個(gè)/ml，流加培養(yǎng)達(dá)到7～8×106個(gè)/ml。將最終優(yōu)化的培養(yǎng)基放大到生物反應(yīng)器中，細(xì)胞生長情況和抗體表達(dá)產(chǎn)量與搖瓶中一致。該研究為進(jìn)一步動(dòng)物細(xì)胞規(guī)模