穩(wěn)定細(xì)胞株篩選

1、穩(wěn)定株構(gòu)建穩(wěn)定株構(gòu)建FAQFAQ轉(zhuǎn)自微博轉(zhuǎn)自微博思路迪慢病毒包裝思路迪慢病毒包裝1，什么是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染？答：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：顧名思義，外源片段的表達(dá)時(shí)間短暫。這主要是因?yàn)橥庠磳?dǎo)入的裸露的載體整合入基因組的幾率非常低，所以以染色體外(episomal)形式存在，不能隨細(xì)胞分裂而一同復(fù)制導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋導(dǎo)致的。而且考慮到細(xì)胞分裂會稀釋質(zhì)粒的量，所以起初轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？截悢?shù)極高。這就導(dǎo)致瞬時(shí)轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)一個(gè)高拷貝到低拷貝迅速降低的過程，且無法在這

2、個(gè)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)可誘導(dǎo)表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：是相對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而言，進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組中，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。在這個(gè)系統(tǒng)中，質(zhì)粒表達(dá)穩(wěn)定，拷貝數(shù)低，且能實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并不是一種與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同的方法，只是對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定整合的細(xì)胞株。穩(wěn)定整合的幾率因基因傳遞的方法而異，跨度可以從108到101。因此，對于有的轉(zhuǎn)染方法，比如化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其整合幾乎可以忽略不計(jì)。質(zhì)粒載體整合的位點(diǎn)并不是完全隨機(jī)分布，依據(jù)

3、不同的基因傳遞方法，呈現(xiàn)不同的靶向傾向性，所以是一種半隨機(jī)整合。不同基因傳遞方法對質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)的影響見表XXXX。2，設(shè)計(jì)穩(wěn)定株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)需要考慮的因素有哪些？?答：穩(wěn)定整合試驗(yàn)中需要考慮的幾個(gè)關(guān)鍵因素有：?2)，需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過表達(dá)基因或者干擾目的基因引起細(xì)胞毒性或者抑制細(xì)胞生長等不利因素?b)，目的基因的過表達(dá)或者干擾需要時(shí)空特異性。?3)，希望控制目的基因過表達(dá)或者干擾的拷貝數(shù)，以避免引入人為因素影響

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。?4)，部分細(xì)胞種類，病毒載體亦無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，達(dá)到外源片段的高效表達(dá)。?5)，長期在少數(shù)幾類細(xì)胞中研究幾個(gè)基因的功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極大方便實(shí)驗(yàn)研究。?6)，部分蛋白穩(wěn)定性極強(qiáng)，瞬時(shí)RNA干擾因?yàn)樽饔弥芷诙?，只能抑制目的基因的表達(dá)，但無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效