穩(wěn)定表達(dá)軟骨調(diào)節(jié)素I的大鼠MSCs細(xì)胞株的建立.pdf

1、目的：構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并驗(yàn)證其在MSCs中的上調(diào)表達(dá)，建立ChM-Ⅰ穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)的MSCs細(xì)胞株，為進(jìn)一步開展ChM-Ⅰ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化，構(gòu)建組織工程軟骨相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．用Trizol法提取大鼠軟骨組織總RNA，根據(jù)ChM-Ⅰ基因序列(序列號(hào)：AF051425)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為：5'GCAGACAAGC

2、TTATGACAGAGAACTCGGACA3’，下游引物為：5' GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG3’，通過PCR獲取ChM-Ⅰ目的基因，分別將ChM-Ⅰ目的基因的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒雙酶切，并將兩者定向連接，構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽性單克隆并擴(kuò)增，酶切鑒定陽性克隆，并對(duì)插入的ChM-Ⅰ片段進(jìn)行測(cè)序。
　　 2．密度梯度離心法獲得大鼠M

3、SCs，傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原；對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，檢測(cè)所獲得MSCs的潛在分化能力。
　　 3．脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠MSCs。實(shí)驗(yàn)分三組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒)；對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒)；空白組。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠MSCs的最佳G418篩選濃度為200ug/ml。轉(zhuǎn)染復(fù)合體作用6小時(shí)后，更換完全培養(yǎng)基，48小時(shí)后加入200ug/ml

4、G418篩選培養(yǎng)基，使用篩選培養(yǎng)基持續(xù)傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的大鼠MSCs。
　　 4．取穩(wěn)轉(zhuǎn)后連續(xù)培養(yǎng)三代的大鼠MSCs提取總RNA和蛋白質(zhì)，使用RT-PCR和Western blot分別在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)ChM-Ⅰ在各組大鼠MSCs細(xì)胞株內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，鑒定所篩選的大鼠MSCs細(xì)胞株中ChM-Ⅰ的上調(diào)表達(dá)及其穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果：
　　 1．對(duì)陽性克隆鑒定及測(cè)序和序列分析

5、對(duì)比，結(jié)果顯示與ChM-Ⅰ基因長(zhǎng)度相符，序列無誤，且讀碼框正確。
　　 2．單細(xì)胞懸液接種48小時(shí)后換液，倒置顯微鏡觀察并拍照，可于培養(yǎng)皿底部見到呈梭形或三角形的貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)11-13天后培養(yǎng)皿底部細(xì)胞密度達(dá)到90％以上。細(xì)胞傳代，在6小時(shí)內(nèi)可達(dá)80%以上貼壁，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，可見細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，折光性較強(qiáng)，可呈魚群樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果：MSCs陽性表面抗原CD90、CD29的表達(dá)率分別為99.79%、98.4

6、1%； MSCs陰性表面抗原CD45、CD11b/c的表達(dá)率分別為2.77%、2.51%。成脂誘導(dǎo)2周后，油紅0染色，脂滴為橙紅色；成骨誘導(dǎo)3周后，茜素紅染色，鏡下顯現(xiàn)為紅色斑片。
　　 3．轉(zhuǎn)染復(fù)合體作用6小時(shí)后，可見大量MSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)折光性強(qiáng)的小泡，提示陽離子脂質(zhì)體已結(jié)合質(zhì)粒進(jìn)入MSCs。48小時(shí)后加入200ug/mlG418篩選培養(yǎng)基5天后空白組出現(xiàn)少量細(xì)胞漂浮死亡，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組也可見少量細(xì)胞死亡。7天后空白組出現(xiàn)大

7、量死亡，14天后空白組細(xì)胞全部死亡，兩個(gè)轉(zhuǎn)染組大約有10%的細(xì)胞存活，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不再死亡，開始增殖，生長(zhǎng)速度逐漸加快。傳代后，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，排列密集整齊，呈編織狀旋渦狀。
　　 4．RT-PCR結(jié)果：采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作為評(píng)定指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分別為1.0817±0.2233、0.3601±0.1260、0.3687±0.0086；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義P＜0.05，對(duì)照組與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。Western blot結(jié)果：采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作為評(píng)定指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分別為0.9867±0.0204、0.4155±0.0206、0.3751±0.0081；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，對(duì)照組與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果提示：實(shí)驗(yàn)組中的ChM-Ⅰ在mRNA水平和蛋白