抗FMDV核酶的篩選及其重組成纖維細(xì)胞株的建立.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一種世界性分布的傳染病,具有傳播速度快、感染力強(qiáng)、偶蹄類動物易感等特性。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)具有7個(gè)血清型和80個(gè)以上的亞型,該病毒各型之間無交叉免疫力,且非常容易發(fā)生變異。這些特點(diǎn)使得該病在世界范圍內(nèi)不斷暴發(fā)流行,給畜牧業(yè)造成了巨大的損失。目前,世界各國除了研制開發(fā)FMD新型疫苗外,還積極探索其他有效的預(yù)防策略,

2、如利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高動物自身對FMD的抵抗能力,以達(dá)到防止該病流行的目的。核酶是一類具有催化活性的小RNA,它可以特異性的結(jié)合并切斷病毒RNA,使病毒失活。此外,核酶不影響宿主細(xì)胞mRNA的正?；钚?所以它是一種高效的、安全的新型酶。錘頭狀核酶是核酶家族眾多成員中的一員,較其它核酶具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、作用位點(diǎn)特異等優(yōu)點(diǎn),目前已被許多國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用到疾病基因治療的研究中,為抗FMDV的研究提供了一個(gè)新的思路。我們可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使動

3、物自身表達(dá)抗FMDV的核酶,使病毒在動物體內(nèi)不能復(fù)制及表達(dá),以達(dá)到抗FMD的目的。
　　 在對O型FMDV CHA／99毒株2B、3D基因的RNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的前提下,根據(jù)錘頭狀核酶的設(shè)計(jì)原則,針對2B及3D基因片段尋找到6個(gè)錘頭狀核酶的催化作用位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成出特異性的錘頭狀核酶；構(gòu)建pEGFP-N1-2B、pEGFP-N1-3D重組表達(dá)質(zhì)粒,分別與對應(yīng)的錘頭狀核酶共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞檢測的

4、方法篩選出有效的核酶,在細(xì)胞水平上檢測其對FMDV的抑制效果。將篩選出的核酶基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGPU6／GFP／Neo-D42,轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞,通過G418篩選獲得單克隆細(xì)胞株,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用RT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 熒光顯微鏡下觀察共轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)核酶D42能使熒光減弱,抑制了pEGFP-N1-3D的表達(dá)；流式細(xì)胞檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了核酶D42的催化效率,可高達(dá)71％；通過對細(xì)胞病變程度的觀察發(fā)

5、現(xiàn),在相同時(shí)間內(nèi),轉(zhuǎn)染了核酶D42的實(shí)驗(yàn)組病變細(xì)胞數(shù)目少于未轉(zhuǎn)染核酶D42的陽性對照組,說明在細(xì)胞水平上D42對FMDV也有明顯的抑制效果；將pGPU6／GFP／Neo-D42重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入山羊成纖維細(xì)胞,用800μg／mL濃度的G418進(jìn)行細(xì)胞篩選,12天后得到一株表達(dá)D42核酶的單克隆細(xì)胞株,挑取單克隆細(xì)胞并傳代培養(yǎng),RT-PCR結(jié)果表明D42核酶已成功整合到該單克隆細(xì)胞株中。
　　 本論文運(yùn)用核酶催化原理抑制FMDV的