1,25-二羥基維生素D3對實驗性結腸炎腸黏膜屏障的保護作用與機制研究.pdf

1、潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種高復發(fā)的腸道炎性疾病，是我國炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）的主要臨床形式之一。由于其發(fā)病機制不明，目前尚無有效防治措施，因此，研究UC的發(fā)病機制，探索有效的防治措施具有重要意義。
　　 目前認為UC發(fā)病是由于腸道共生菌及其產物突破腸黏膜屏障，誘導黏膜局部發(fā)生持續(xù)的免疫反應，引發(fā)組織炎癥。正常情況下，腸道上皮細胞組成一道完整

2、的黏膜屏障，阻止微生物及毒性大分子通過，可見腸黏膜屏障完整性是阻止細菌入侵及移位的關鍵。眾所周知，緊密連接(Tight Junction，TJ)是細胞間的重要連接方式，對維持黏膜屏障的完整性起決定作用。因此，腸上皮緊密連接受損在UC的發(fā)病中扮演著關鍵角色。
　　 腸黏膜屏障功能缺陷時，微生物抗原可以進入腸黏膜固有層，從而誘導效應T細胞活化，啟動黏膜免疫反應；研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞是腸黏膜炎癥反應的主要效應細胞，其輔助細胞亞群—

3、—Th17細胞以分泌白細胞介素17(IL-17)為主，后者是一種促炎因子，具有強大的募集和激活嗜中性粒細胞的能力，能誘導活化T細胞產生多種促炎介質如IL-1、IL-6、TNF-α等而誘發(fā)加重炎癥反應。因此，深入探討UC發(fā)病中腸黏膜屏障的作用與免疫調節(jié)機制具有重要意義。
　　 1，25-二羥基維生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25(OH)2D3)是機體內維生素D的活性形式，也是一種具有生物活性的類固

4、醇激素，具有明確的抗感染作用，其缺乏可致呼吸道、消化道黏膜等部位感染風險明顯增高。研究顯示，1，25(OH)2D3可抑制炎性細胞因子、上調緊密連接蛋白的表達。同時，1，25(OH)2D3也具有免疫調節(jié)作用，流行病學研究表明，在混合型結締組織病患者中1，25(OH)2D3缺乏明顯，其中1，25(OH)2D3的缺乏程度與血清中IFN-γ、IL-6、IL-17含量呈正比。1，25(OH)2D3的產生與作用不足可能參與了UC的發(fā)病，我們推測1，

5、25(OH)2D3可能通過調節(jié)腸道緊密連接蛋白表達，從而維持黏膜屏障完整性，抑制致病菌入侵及移位，因此，本實驗對1，25(OH)2D3在急、慢性期實驗性結腸炎腸黏膜屏障中的保護作用與機制進行了深入研究，具體實驗分為以下四部分：
　　 第一部分、1，25-二羥基維生素D3改善急、慢性期實驗性結腸炎小鼠腸黏膜炎癥
　　 目的：觀察1，25(OH)2D3對急、慢性期實驗性結腸炎小鼠腸黏膜炎癥的影響。
　　 方法：①通過

6、飲用2％右旋葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）7天可以成功建立急性期實驗性結腸炎模型，C57B/L小鼠隨機分為正常對照組、模型組、1，25(OH)2D3組，每組10只；1，25(OH)2D3組應用1，25(OH)2D3灌胃(0.2μg/25g體重，1次/天)，正常對照組和模型組均用等體積PBS灌胃，共14天。慢性期實驗性結腸炎模型則通過在第1～5天、8～12天、15～19天和22～26天的時間段內飲用2

7、％的DSS，第27、28天及其它時間飲用蒸餾水成功建立，C57B/L小鼠隨機分為3組：正常對照組、模型組、1，25(OH)2D3組，每組10只。1，25(OH)2D3組在模型建立第14天時即給予1，25(OH)2D3（0.005μg/d，1次/d，溶于花生油中）灌胃，正常對照組及模型組以同體積的花生油灌胃，第29天處死動物；②腸黏膜炎癥改變的評估包括每天體重(Body weight，BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activi

8、ty index，DAI)、結腸長度、重量變化等指標，以及結腸形態(tài)學改變和病理評分；③采用掃描電鏡觀察結腸組織上皮黏膜超微結構變化。
　　 結果：①在急性期結腸炎小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組動物體重明顯減輕，給予1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組動物體重較模型組明顯回升；模型組動物DAI評分(3.00±0.41vs0.00±0.00，P＜0.01)及病理評分明顯增加（8.60±1.67vs5.00±0

9、.00，P＜0.01）明顯高于正常對照組，結腸長度縮短(4.88cm±0.63cmvs6.80cm±0.27cm，P＜0.01)，結腸壁充血、水腫明顯(2.00±0.71vs0.00±0.00，P＜0.01)，結腸組織病理切片顯示中性粒細胞浸潤明顯；但給予1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組DAI評分(0.00±0.00vs0.70±0.41，P＜0.01)及病理評分(7.40±0.55 vs8.60±1.67，P＜0

10、.01)較模型組顯著降低，同時結腸長度有所增長(6.10cm±0.42cmvs4.88cm±0.63cm，P＜0.01)，結腸壁充血及水腫明顯減輕(0.60±0.55vs2.00±0.71，P＜0.01)，結腸組織病理切片提示中性粒細胞浸潤明顯減少；②在慢性期實驗性結腸炎小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組動物體重明顯減輕，經(jīng)1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組動物體重較模型組明顯回升；與正常對照組相比，模型組動物DA

11、I積分增加（4.00±0.43 vs0.00±0.00，P＜0.01），結腸長度明顯縮短（5.03cm±0.56 cm vs5.98cm±0.44cm，P＜0.01），結腸壁充血、水腫明顯(2.17±0.98 vs0.00±0.00，P＜0.01)，結腸組織病理切片顯示中性粒細胞、淋巴細胞浸潤明顯，直腸、近端結腸、末端回腸病理評分顯著增加（8.80±0.45 vs5.40±0.55、9.80±0.45 vs5.40±0.55、8.80±

12、0.84 vs5.40±0.55，P＜0.01）；但經(jīng)過1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組DAI評分顯著降低（0.30±0.46 vs0.70±0.30，P＜0.01），結腸長度增加不明顯（5.27±0.46 vs5.03±0.56，P<0.05）及直腸、近端結腸、末端回腸病理評分較模型組明顯降低(8.60±0.55 vs8.80±0.45、9.00±0.71 vs9.80±0.45、8.00±0.89 vs8.80

13、±0.84，P＜0.05)，結腸壁充血、水腫明顯減輕（1.33±0.52 vs2.17±0.98，P＜0.01），結腸組織病理切片結果提示淋巴細胞浸潤明顯減少；③掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)觀察結果表明，正常對照組小鼠結腸組織上皮完整，無損傷；模型組則表現(xiàn)為典型炎癥黏膜紊亂，部分黏膜缺失，但經(jīng)過1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組黏膜缺失較模型組減輕，偶見隱窩擴大。

14、>　　 結論：1，25(OH)2D3可以減輕急、慢性期UC小鼠腸黏膜炎癥反應。
　　 第二部分、1，25-二羥基維生素D3對急、慢性期實驗性結腸炎腸黏膜屏障的保護作用
　　 目的：觀察1，25(OH)2D3對急、慢性期實驗性結腸炎模型小鼠結腸黏膜屏障的保護作用。
　　 方法：①造模方法同第一部分；②對各組動物腸系膜淋巴結勻漿液進行細菌培養(yǎng)以明確有無大腸桿菌感染；③通過熒光分光光度計檢測小鼠血清中異硫氫酸熒光素葡

15、聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-D)的含量；偶氮基質顯色法檢測血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）含量；④采用免疫組織化學染色法、免疫熒光染色法、western blot和real-time Q-PCR技術檢測急、慢性期模型各組小鼠結腸組織中閉鎖蛋白(occludin)、水閘蛋白(claudin)和閉鎖小帶(zonula occludens，Zos)蛋白及其m

16、RNA的表達。
　　 結果：①與正常對照組相比，模型組小鼠血清中FITC-D和LPS的含量顯著增加（FITC-D:933.4±133.5 vs4266.8±326.6,P＜0.01;LPS:0.119±0.05 vs0.224±0.06,P＜0.01）；而1,25(OH)2D3組小鼠血清中FITC-D和LPS的含量較模型組明顯降低(FITC-D:253.4±222.9 vs4266.8±326.6,P＜0.01;LPS:0.13

17、8±0.06 vs0.224±0.06,P＜0.01)。②正常對照組小鼠腸系膜淋巴結勻漿液中無細菌移位(0％)，與正常對照組相比，模型組小鼠細菌移位率明顯增加(80％)，而1,25(OH)2D3組，淋巴結細菌移位較模型組明顯降低(40％)。③免疫組織化學染色及免疫熒光染色檢測結果顯示：急、慢性期模型組小鼠腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達水平較正常對照組顯著降低，而1,25(OH)2D3組zo-1、occlu

18、din和claudin-1蛋白表達水平較模型組明顯增加。④Western blot和real-time Q-PCR檢測結果顯示：在急性期小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組小鼠結腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表達明顯降低（蛋白：0.60±0.05 vs1.37±0.04、0.11±0.01 vs0.25±0.03、0.44±0.04 vs0.95±0.04,P＜0.05;mRNA:0.46±0.03

19、 vs1.00±0.07、0.36±0.02 vs1.00±0.04和0.85±0.05 vs1.00±0.05,P＜0.01）；而1,25(OH)2D3組與模型組比較小鼠結腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表達明顯增加（蛋白：1.31±0.15 vs0.60±0.05、0.23±0.03 vs0.11±0.01、0.93±0.01 vs0.44±0.04,P＜0.05;mRNA:0.97±0.04 v

20、s0.46±0.03、0.98±0.01 vs0.36±0.02、1.00±0.04 vs0.85±0.05,P＜0.01）。在慢性期小鼠模型中：與正常對照組相比，模型組小鼠直腸、近端結腸、末端回腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:0.98±0.03 vs1.56±0.02、0.34±0.03 vs0.76±0.020、0.24±0.02 vs0.65±0.03,P＜0.01;occludin:1.48

21、±0.03 vs1.56±0.03、1.64±0.02 vs1.76±0.03、1.44±0.03 vs1.65±0.02,P＜0.01;claudin-1:1.10±0.03 vs1.36±0.03、1.04±0.02 vs1.66±0.03、1.44±0.03 vs1.85±0.02,P＜0.01)和mRNA(zo-1:0.83±0.05 vs1.03±0.05、0.60±0.04 vs1.01±0.05、0.69±0.03 vs1

22、.02±0.05,P＜0.01;occludin:0.90±0.04 vs1.01±0.05、0.93±0.04 vs1.03±0.05、0.90±0.05 vs1.04±0.05,P＜0.01;claudin-1:0.77±0.02 vs1.02±0.05、0.55±0.02 vs1.01±0.05、0.66±0.03 vs1.04±0.05,P＜0.01）表達水平明顯下降；而1,25(OH)2D3組與模型組小鼠比較直腸、近端結腸、末

23、端回腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:1.35±0.02 vs0.83±0.05、0.63±0.02 vs0.34±0.03、0.55±0.02 vs0.24±0.02,P＜0.01;occludin:1.45±0.02 vs1.48±0.03、1.63+0.02 vs1.64±0.02、1.56±0.02 vs1.44±0.03,P＜0.01;claudin-1:1.25+0.02 vs1.10±0

24、.03、1.43±0.02 vs1.04±0.02、1.65±0.02 vs1.44±0.03,P＜0.01)和mRNA(zo-1:0.94±0.02 vs0.83±0.05、0.67±0.01 vs0.60±0.04、0.74±0.01 vs0.69±0.03，P＜0.01;occludin:0.94±0.02 vs0.90±0.04、0.94±0.03 vs0.93±0.04、0.94±0.01 vs0.90±0.05,P＜0.01

25、;claudin-1:0.84±0.02 vs0.77±0.02、0.77±0.02 vs0.55±0.02、0.74±0.01 vs0.66±0.03，P＜0.01)表達水平明顯增加。
　　 結論：1，25(OH)2D3有助于改善炎癥引起的腸道黏膜損傷，其機制可能與降低腸黏膜屏障的通透性、維持黏膜屏障結構和功能有關。
　　 第三部分、1，25-二羥基維生素D3對慢性期實驗性結腸炎CD4+T細胞功能的影響
　　

26、目的：探討1，25(OH)2D3對DSS誘導的慢性期實驗性結腸炎模型小鼠CD4+T細胞功能的影響。
　　 方法：①觀察脾臟長度、脾臟重量變化；②分離脾臟單個核細胞數(shù)并計數(shù)，應用流式細胞術檢測脾臟單個核細胞中免疫細胞的陽性率；③分離結腸黏膜固有層、腸系膜淋巴結中單個核細胞數(shù)并計數(shù)；④應用real-timeQ-PCR技術分析結腸組織中炎性細胞因子TNF-αmRNA、IFN-γ mRNA、IL-17 mRNA、IL-6 mRNA的表達

27、變化。
　　 結果：①同正常對照組相比，DSS模型組小鼠脾臟長度、重量增加，（脾臟長度：1.37cm±0.27cm vs1.22cm±0.12cm，P＞0.05;脾臟重量：0.09g±0.02g vs0.06g±0.02g，P＞0.05）而給予1，25(OH)2D3干預后，同DSS模型組相比，小鼠脾臟長度稍下降、重量稍減輕（脾臟長度：1.32cm±0.12cm vs1.37cm±0.27cm;脾臟重量：0.084g±0.02g

28、vs0.09g±0.02g)但均P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；②細胞計數(shù)結果顯示，1，25(OH)2D3組脾臟單個核細胞數(shù)量較DSS模型組顯著減少(76.80×106±18.60×106/mL vs108.00×106±20.30×106/mL，P＜0.01）；進一步采用流式細胞術檢測脾臟單個核細胞中免疫細胞所占的陽性比率，結果顯示給予1，25(OH)2D3干預后，小鼠脾臟單個核細胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細胞陽性率與模型組比

29、較顯著降低(36.58％±0.70％ vs54.10％±0.97％、19.80％±0.73％ vs29.02％±0.68％、14.40％±0.70％ vs18.82％±0.54％、26.82％±0.47％ vs54.40％±0.87％，P＜0.01）；③給予1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D3組小鼠腸系膜淋巴結（Mesenteric lymph node，MLN）和結腸黏膜固有層單個核細胞（Lamina propria

30、mononuclear cells，LPMC）數(shù)量與模型組相比顯著降低（MLN:2.52×106/mL±0.74×106/mL vs3.42×106/mL±0.40×106/mL,P＜0.01;LPMC:0.32×106/mL±0.14×106/mL vs0.88×106/mL±0.08×106/mL，P＜0.01);④Real-time Q-PCR檢測結果顯示，與DSS模型組相比，給予1，25(OH)2D3干預后，1，25(OH)2D

31、3組結腸組織中TNF-α mRNA、IFN-γ mRNA、IL-17 mRNA和IL-6 mRNA表達水平均顯著降低(5.48±0.08 vs9.30±0.07、7.74±0.11 vs14.38±0.08、3.28±0.11 vs6.38±0.08、4.54±0.10 vs7.38±0.07,P＜0.01)。
　　 結論：1，25(OH)2D3可減輕DSS誘導的小鼠慢性期結腸炎的腸損傷，其機制可能與降低脾臟單個核細胞中免疫細胞

32、的陽性率以及抑制腸組織中的TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6等細胞因子有關。
　　 第四部分、1，25-二羥基維生素D3對體外Caco-2細胞屏障的保護作用與機制研究
　　 目的：探討1，25(OH)2D3對DSS誘導的體外培養(yǎng)的Caco-2細胞屏障的保護作用與機制研究。
　　 方法：①Caco-2細胞形成體外腸上皮細胞屏障模型后，實驗分為vehical組（溶劑對照組）、DSS組、1，25(OH)2D3

33、10-9M組、1，25(OH)2D310-8M組和1，25(OH)2D310-7M組；②通過測量單層上皮的電阻（Transepithelial electrical resistance，TEER）和熒光素異硫氰酸酯葡聚糖(Fluorescein isothiocyanate dextran，F(xiàn)ITC-D)通透率檢測單層細胞的電阻與通透率改變；③應用透射電鏡觀察1，25(OH)2D3干預后Caco-2單層細胞的超微結構改變；④采用免疫熒

34、光染色方法、Western blot技術和real-time Q-PCR方法檢測zo-1、occludin和claudin-1的蛋白及其mRNA在單層細胞的表達。
　　 結果：①體外腸上皮細胞屏障模型成功建立；②對FITC-D通透率的結果分析顯示：DSS組較vehical組明顯升高（51.83±2.48 vs5.5±1.05，P＜0.01），1，25(OH)2D310-9M組、1,25(OH)2D310-8M組和1,25(OH)

35、2D310-7M組則較DSS組顯著降低（18.5±1.05，8.17±1.17，18.5±1.05，P＜0.01）；進一步采用透射電鏡觀察，顯示DSS組細胞的緊密連接樣結構消失，而1，25(OH)2D3各劑量組細胞的緊密連接樣結構有不同程度的恢復，但仍未能完全恢復正常；③免疫熒光染色結果表明：vehical組zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達連續(xù)完整，熒光密度強度高；DSS組上述三種蛋白表達斷續(xù)不完整，熒光強度弱；而

36、1，25(OH)2D310-9M組、1，25(OH)2D310-8M組和1，25(OH)2D310-7M組較DSS組明顯好轉；④Western blot對zo-1、occludin、claudin-1蛋白檢測結果顯示：DSS組較vehical組顯著降低(0.80+0.16 vs1.51±0.20、0.99±0.13 vs1.66±0.14、0.76±0.09 vs1.79±0.11,P＜0.01)，而給予1，25(OH)2D310-8M

37、治療后，其緊密連接zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達水平明顯高于DSS組(1.20±0.12 vs0.80±0.16、1.47+0.13 vs0.99±0.13、1.68±0.11 vs0.76±0.09,P＜0.01),1,25(OH)2D310-9M，1，25(OH)2D310-7M干預后，其緊密連接occludin和claudin-1蛋白的表達水平與DSS組相比明顯增加，P＜0.01；但1，25(OH)2D31

38、0-9M，1，25(OH)2D310-7M干預后，zo-1蛋白表達水平與DSS組相比無明顯增加，P＞0.05；Real-timeQ-PCR檢測結果顯示：DSS組較vehical組顯著降低(0.67+0.11 vs1.00±0.00、0.63±0.07 vs1.00±0.00、0.70±0.07 vs1.00±0.00,P＜0.01），而給予1，25(OH)2D310-8M治療后，其緊密連接zo-1 mRNA、occludin mRNA、

39、claudin-1 mRNA表達水平與DSS組相比，明顯增加(0.84+0.08 vs0.67±0.11、0.84±0.08 vs0.63±0.07、0.9±0.08 vs0.70±0.07,P＜0.01），1，25(OH)2D310-9M，1，25(OH)2D310-7M干預后，其緊密連接zo-1mRNA、occludin mRNA、claudin-1 mRNA的表達水平與DSS組相比也明顯增加，P＜0.01。
　　 結論：體