1,25-雙羥維生素D3對實驗性自身免疫性脊髓炎小鼠自噬的調(diào)控作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化不僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，也是一種神經(jīng)變性疾病，其發(fā)病率和地理緯度具有明顯相關(guān)性，越遠(yuǎn)離赤道，多發(fā)性硬化的發(fā)病率越高。本實驗選用1，25(OH)2D3作為干預(yù)藥物，研究其治療多發(fā)性硬化的有效性，不僅研究其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)髓鞘的影響，還深入研究對灰質(zhì)神經(jīng)元的作用，并進(jìn)一步探索其潛在的作用機制。
　　方法:將27只周齡在8-10周左右，體重在18-20g左右的C57BL/6雌性小鼠隨機分為正常對照組，EAE

2、組，VD3組(即1，25(OH)2D3給藥組），各組均為9只。
　　以MOG多肽為抗原免疫后兩組小鼠建立EAE動物模型。以250μg人工合成MOG35-55多肽溶到500μl生理鹽水中，和等體積含1mg/ml結(jié)核菌素的完全福氏佐劑(CFA)混合，加入結(jié)核桿菌H37Ra使結(jié)核菌素補充至400ng，充分混勻至油包水乳劑，制成完全抗原，雙側(cè)背部分4點皮下注射。于免疫后的第0和48h兩次給予小鼠腹腔內(nèi)注射500ng的百日咳毒素，以建立小鼠

3、的EAE模型。免疫當(dāng)天記為0天。VD3組小鼠自免疫當(dāng)天起每隔兩日腹腔注射0.1ml1，25(OH)2D3(用潔凈蓖麻油稀釋至濃度為1ug/ml)，空白對照組和EAE組小鼠均同天腹腔注射0.1ml蓖麻油，直至處死。從免疫當(dāng)天開始，每天早晚(8:00和16:00)兩次由兩位觀察者分別對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能的評分、稱重并給予記錄。于免疫后第20天，對三組小鼠進(jìn)行取材。斷頸處死小鼠后，對小鼠大腦組織新鮮取材，切分成兩部分，前三分之一，后三分之二

4、（此部分以下稱為側(cè)腦室旁腦組織），一部分迅速投入液氮進(jìn)行快速冷凍，后置于一80℃冰箱保存，進(jìn)行WesternBlot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)情況;對脊髓腰骶膨大組織新鮮取材后置于4％多聚甲醛保存，部分制成石蠟切片，進(jìn)行HE、LFB、Nissl染色，觀察炎性細(xì)胞的浸潤、脫髓鞘情況及神經(jīng)元形態(tài)數(shù)目變化;剩余部分的側(cè)腦室旁腦組織和腰骶膨大組織則制成冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光法檢測，分別單染NeuN觀察神經(jīng)元的變化，雙染NeuN

5、和Beclin1， NeuN和LC3，觀察神經(jīng)元自噬水平的變化。
　　數(shù)值采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，EAE發(fā)病率應(yīng)用Fisher's確切概率法，臨床評分應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗。兩組間炎性浸潤及脫髓鞘對比應(yīng)用t檢驗。多組間的計量資料均數(shù)比較應(yīng)用One-Way ANOVA檢驗，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗或Dunnett's檢驗。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、1，25(OH)2D3有效改善E

6、AE小鼠的臨床癥狀
　　空白對照組（Control組）小鼠均未發(fā)病，活動、食欲等方面均正常。EAE組小鼠發(fā)病率達(dá)100％，自免疫第一天即出現(xiàn)不同幅度的體重下降，之后逐漸出現(xiàn)活動減少、尾巴無力、反應(yīng)不靈敏和皮毛不光滑等癥狀。1，25(OH)2D3治療組（VD3組）小鼠至取材發(fā)病率僅為11.1％(P＜0.01)。通過比較后兩組中小鼠每天的神經(jīng)功能評分的均數(shù)發(fā)現(xiàn)，自第11天開始，VD3組小鼠的神經(jīng)功能評分顯著地低于EAE組小鼠（第11天

7、，P＜0.05;之后P＜0.01）。
　　2、1，25(OH)2D3明顯減輕EAE小鼠脊髓炎性細(xì)胞的浸潤及髓鞘脫失
　　2.1小鼠腰骶膨大組織HE染色示:Control組小鼠未見炎性細(xì)胞的浸潤及“血管袖套”樣情況;處于發(fā)病高峰期的EAE組小鼠脊髓組織切片內(nèi)可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤，個別的切片內(nèi)存在“血管袖套”樣改變;VD3組小鼠脊髓組織基本未見炎性細(xì)胞浸潤征象。HE染色病理評分存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.2小鼠腰骶膨大LF

8、B染色示:Control組小鼠未見明顯髓鞘脫失情況;EAE組發(fā)病高峰期小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)可見成片的髓鞘脫失區(qū)域，呈現(xiàn)白色空泡樣變;VD3組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘基本完整，未見明顯脫失區(qū)域。LFB染色病理評分存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、1，25(OH)2D3有效預(yù)防EAE小鼠脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的脫失
　　3.1小鼠腰骶膨大Nissl染色示:與Control組相比，EAE組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)Nissl標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目顯著減少（P＜0.01），且呈

9、現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元損傷，如明顯核皺縮、尼氏體數(shù)目減少等現(xiàn)象。而VD3組小鼠脊髓內(nèi)Nissl標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目則較EAE組增多(P＜0.01)。
　　3.2免疫熒光染色顯示:與Control組相比，EAE組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，而VD3組小鼠脊髓內(nèi)NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目則較EAE組增多。
　　4、發(fā)病高峰期的EAE小鼠體內(nèi)自噬水平存在異常，1，25(OH)2D3可調(diào)控EAE小鼠的自噬水平
　　4

10、.1免疫印跡示:發(fā)病高峰期的EAE小鼠與Control組小鼠相比，Beclin1的表達(dá)明顯下降，差異顯著(P＜0.05)，而VD3組小鼠Beclin1的表達(dá)則較EAE組小鼠明顯升高（P＜0.05）。而LC3-Ⅱ在各組的表達(dá)則呈現(xiàn)出相反的趨勢，可見發(fā)病高峰期的EAE小鼠與Control組小鼠相比，LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，而VD3組小鼠LC3-Ⅱ的表達(dá)則較EAE組小鼠明顯降低(P＜0.05)。增設(shè)EAE氯喹干預(yù)組，顯示發(fā)病

11、高峰期的氯喹治療組小鼠與EAE組小鼠相比，LC3-Ⅱ的水平未見明顯變化。
　　4.2免疫熒光示:在Control組小鼠神經(jīng)元內(nèi)可檢測到Beclin1呈一定水平的表達(dá)，而在發(fā)病高峰期的EAE小鼠神經(jīng)元內(nèi)Beclin1的表達(dá)明顯降低，神經(jīng)元數(shù)目有所減少。在VD3組可見Beclin1表達(dá)彌漫性增強。在Control組及VD3組小鼠神經(jīng)元內(nèi)幾乎檢測不到LC3的表達(dá)，而在發(fā)病高峰期的EAE小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3表達(dá)增強。
　　結(jié)論: