1,25-二羥維生素D3聯(lián)合特異性免疫療法對(duì)小鼠哮喘模型的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一。近年來(lái)，其患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢(shì)。過(guò)敏性哮喘是在過(guò)敏原刺激下，由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性變應(yīng)性炎癥，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-3]。過(guò)敏性哮喘的特征為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[4，5]。其中，免疫-炎癥反應(yīng)是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，抗原通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)激活T細(xì)胞，活化的輔

2、助性T細(xì)胞(主要是Th2細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13等進(jìn)一步激活B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞，造成氣道炎癥反應(yīng)。因此，在過(guò)敏性哮喘中，過(guò)敏原通過(guò)APC激活T細(xì)胞是發(fā)生氣道炎癥的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。
　　 特異性免疫療法(specific immunotherapy，SIT)通常稱(chēng)為脫敏治療。SIT為治療過(guò)敏性支氣管哮喘提供了不同于常規(guī)藥物(如腎上腺糖皮質(zhì)激素，氨茶堿和

3、β2-受體激動(dòng)劑等)的治療方法，是目前已知唯一針對(duì)哮喘病因的治療，成功的SIT可改變過(guò)敏性疾病的自然病程[6，7]。既往受到接種疫苗治療傳染性疾病獲得巨大成功的啟示，早在1911年，Noon和Freeman開(kāi)始使用特異的過(guò)敏原治療過(guò)敏性疾病[21]。從那時(shí)起，皮下SIT在臨床治療中逐漸得到發(fā)展和完善。近一個(gè)世紀(jì)，皮下SIT被認(rèn)為是治療過(guò)敏性疾病(例如，對(duì)昆蟲(chóng)毒液，屋塵螨，花粉或動(dòng)物皮屑等過(guò)敏)的一種重要的治療措施[8，9]。
　　

4、 SIT的作用機(jī)制尚不完全清楚[10，11]。目前認(rèn)為，SIT主要是通過(guò)改變機(jī)體的免疫狀態(tài)而達(dá)到治療過(guò)敏性疾病的作用，成功的SIT能夠誘發(fā)過(guò)敏機(jī)體對(duì)特異性抗原產(chǎn)生耐受，期間誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells，Tregs)發(fā)揮了重要作用[10-14]。但是，由于脫敏治療存在可能誘發(fā)過(guò)敏性不良反應(yīng)(如嚴(yán)重的過(guò)敏性休克)、療程長(zhǎng)以及療效個(gè)體差異較大等原因，影響了該療法的臨床應(yīng)用[15]。因此，需要不斷深入探討改善S

5、IT治療過(guò)敏性哮喘的方法及其機(jī)制。
　　 1，25二羥維生素D3[1，25(OH)2D3，VitD3]是維生素D的活性代謝產(chǎn)物。VitD3除在骨形成和鈣的代謝過(guò)程中具有重要作用外，還通過(guò)表達(dá)在APC和活化的T細(xì)胞中的特異性受體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[16]。在與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病研究中發(fā)現(xiàn)，VitD3不僅可以預(yù)防人類(lèi)1型糖尿病[17]和炎癥性腸病動(dòng)物模型的發(fā)病[18]，還能夠延長(zhǎng)同種異體移植存活期，減輕急、慢性排斥反應(yīng)[19]。Vit

6、D3還可誘導(dǎo)單核細(xì)胞源性不成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDCs)表面抗原呈遞分子MHCⅡ和共刺激分子CD40，CD80和CD86的表達(dá)量下調(diào)，影響免疫過(guò)程[20]。
　　 鑒于在既往的研究中顯示SIT和VitD3兩者都有助于形成免疫耐受，可對(duì)變應(yīng)性疾病發(fā)揮治療作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了使用VitD3預(yù)處理聯(lián)合SIT在使用卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏小鼠哮喘模型中對(duì)氣道炎癥、Th1/Th

7、2相關(guān)的細(xì)胞因子分泌、OVA特異性IgE、小鼠脾源性DCs表面共刺激分子表達(dá)和對(duì)Tregs極化的作用；并探討了使用rmIL-4、rmGM-CSF聯(lián)合VitD3誘導(dǎo)骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，觀察DCs在加用OVA和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激對(duì)髓源性DCs中Notch信號(hào)配體Jagged1和Jagged2表達(dá)的影響。為探討使用VitD3作為佐劑，聯(lián)合SIT治療過(guò)敏性哮喘提供

8、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：探討VitD3處理聯(lián)合SIT對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的作用及其機(jī)制
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組：使用BALB/c小鼠(6～8周齡，18～24g)75只，隨機(jī)分為5組(15只/組)分別為正常對(duì)照組，哮喘模型組，VitD3處理組，免疫治療組，VitD3+免疫治療組(簡(jiǎn)稱(chēng)為，聯(lián)合處理組)。其中復(fù)制OVA致敏(佐劑為氫氧化鋁凝膠)-脫敏-激發(fā)的小鼠模型，作為小鼠哮喘模型，并使用H.E染色的

9、方法鑒定。
　　 2.實(shí)驗(yàn)程序：模型制作和處理程序簡(jiǎn)述如下，除外正常對(duì)照組外，其余小鼠致敏使用OVA10μg+Al(OH)32 mg，分別于d0和d7進(jìn)行腹腔注射。正常對(duì)照組使用PBS0.1 ml進(jìn)行致敏。兩周之后，除外正常對(duì)照組、哮喘模型組和VitD3預(yù)處理組之外，另外兩組免疫治療使用OVA100μg分別于d21、d23和d25，在尾根部進(jìn)行皮下注射。正常對(duì)照組和哮喘模型組使用PBS0.1 ml，進(jìn)行尾根部皮下注射。在每次進(jìn)行

10、OVA或PBS免疫治療前24 h(d20，d22和d24)，除外正常對(duì)照組、哮喘模型組和免疫治療組之外，其余兩組預(yù)處理分使用VitD350 ng進(jìn)行腹腔注射。10天之后，除外正常對(duì)照小鼠組，其余4組小鼠使用1％OVA的PBS溶液進(jìn)行超聲霧化吸入，每天30min，時(shí)間為d35、d38和d41。所有小鼠在最后一次霧化吸入24 h后即d42，進(jìn)行各項(xiàng)檢查。
　　 3.支氣管肺泡灌洗：在最后一次激發(fā)24h后，收集上述各組中支氣管肺泡灌洗

11、液(BALF)，離心分離，獲得的沉淀使用瑞氏-姬姆薩染色檢測(cè)其中的細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)；得到的上清液，使用ELISA檢測(cè)氣道炎癥檢測(cè)IL-4，IL-5，IL-10和IFN-γ水平。
　　 4.收集外周血：各組小鼠在進(jìn)行最后一次激發(fā)后24h，采用眼球摘除法收集外周血，分離血清，使用ELISA檢測(cè)血清中OVA特異的IgE(sIgE)水平。
　　 5.采集脾臟：分離、純化各組脾臟中的DCs，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面的共刺激分子C

12、D11c、CD80和CD86的表達(dá)情況；
　　 分離、純化小鼠脾臟CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞，流式檢測(cè)各組小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的百分比值。
　　 4.留取肺標(biāo)本：將各組中小鼠左肺上葉，10％福爾馬林固定，組織切片后進(jìn)行H.E染色。
　　 二、體外實(shí)驗(yàn)：探討加用VitD3誘導(dǎo)骨髓源性DCs被OVA和LPS刺激后Jagged1和Jagged2的表達(dá)變化
　　 1.培養(yǎng)鑒定骨髓源性DCs：拉

13、頸脫臼法處死小鼠，取小鼠股骨、脛骨骨髓，使用rmIL-4(10 ng/ml)、rmGM-CSF(20 ng/ml)連續(xù)培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞。通過(guò)導(dǎo)致光學(xué)顯微鏡觀察、掃描電鏡檢查細(xì)胞形態(tài)，并使用流式檢測(cè)DCs表面標(biāo)志性分子(CD11c、CD80和CD86)的表達(dá)，鑒定小鼠骨髓源性DCs。
　　 2.檢測(cè)VitD3對(duì)誘導(dǎo)骨髓源性DCs中Jagged1和Jagged2表達(dá)的變化
　　 實(shí)驗(yàn)分組：在未加用、加用Vi

14、tD3培養(yǎng)出來(lái)的兩類(lèi)DCs中，根據(jù)培養(yǎng)后期加入的刺激物不同，各自分為對(duì)照組，OVA組，LPS組和OVA+LPS組。
　　 實(shí)驗(yàn)程序：如上方法制備小鼠骨髓細(xì)胞，以1×107/孔加入6孔培養(yǎng)板中，于0d每孔加入rmGM-CSF(20 ng/ml)、rmIL-4(10 ng/ml)，3d、5d和7d進(jìn)行半量換液(同時(shí)補(bǔ)充rmGM-CSF、rmIL-4，在加用VitD3培養(yǎng)時(shí)，還要同時(shí)加入VitD3(1 nmol/L)。，8d加入OVA

15、(100μg/ml)或/和LPS(1μg/ml)，9d再次半量換液(同時(shí)補(bǔ)充rmGM-CSF、rmIL-4，OVA或/和LPS)，48h后即d10收獲細(xì)胞提取的mRNA和蛋白，使用RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)Jageed1和Jagged2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.BALF中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，在正常對(duì)照組為0.16±0.02×104/ml，哮喘模型組為21.

16、84±2.91×104/ml，哮喘模型組比正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為15.73±1.69×104/ml，免疫治療組為13.41±1.67×104/ml，聯(lián)合處理組為7.46±1.34×104/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)雖有下降，但是均無(wú)顯著降低(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合處理組與免疫治療組相比顯著降低P<0.05)

17、，但與正常對(duì)照組相比仍有顯著增高(P<0.05)。
　　 2.肺部病理改變：肺組織切片進(jìn)行H.E染色，與正常對(duì)照組小鼠肺臟相比較，哮喘模型組小鼠肺臟的體積增大、腫脹。可見(jiàn)支氣管及血管周?chē)写罅康难仔约?xì)胞浸潤(rùn)(以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主)。氣管內(nèi)皮部分脫落，基底膜增厚形態(tài)不規(guī)則；VitD3組或只免疫治療組，可減輕小鼠肺組織的氣管基底膜增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道上皮脫落；聯(lián)合處理組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道上皮損傷明顯減輕。
　　

18、 3.血清中sIgE水平：檢測(cè)小鼠血清中sIgE發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組為0.16±0.05 ODunits，哮喘模型組為0.93±0.08 OD units，哮喘組比正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為0.644±0.07 OD units，免疫治療組為0.75±0.06 OD units，聯(lián)合處理組為0.42±0.06 OD units，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比血清中的IgE水平雖有下降，但是均無(wú)顯著降低

19、(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合處理組比免疫治療組顯著降低(P<0.05)，但與正常對(duì)照組相比仍有顯著增高(P<0.05)。
　　 4.BALF中細(xì)胞因子水平：檢測(cè)小鼠BALF中IL-4水平，正常對(duì)照組為31.51±8.32pg/ml，哮喘模型組為58.24±12.51 pg/ml，哮喘組比正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為57.43±8.91 pg/ml，免疫治療組為

20、43.75±6.42 pg/ml，聯(lián)合處理組為7.63±7.87pg/ml，VitD3組、免疫治療組和聯(lián)合處理組分別與哮喘模型組相比BALF中的IL-4水平雖有下降，但是均無(wú)顯著降低(P>0.05)。
　　 BALF中IL-5水平，正常對(duì)照組為28.72±5.86 pg/ml，哮喘模型組為74.62±14.22pg/ml，哮喘組比正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為63.35±11.76 pg/ml，免疫治療組為4

21、9.14±17.35 pg/ml，聯(lián)合處理組為39.97±11.93 pg/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比，BALF中的IL-5水平雖有下降，但是均無(wú)顯著降低(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)。
　　 BALF中IL-10水平，正常對(duì)照組為42.40±9.54 pg/ml，哮喘模型組為37.61±7.63pg/ml，哮喘組比正常對(duì)照組雖有下降，但無(wú)顯著降低(P>0.05)；

22、VitD3組為54.33±17.21 pg/ml，免疫治療組為44.62±13.81 pg/ml，聯(lián)合處理組為67.14±12.57pg/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比，BALF中的IL-10水平雖有上升，但是均無(wú)顯著升高(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著升高(P<0.05)。
　　 5.脾源性樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)：脾源性DCs表面共刺激分子CD80，在正常對(duì)照組為7

23、2.26±3.24％，哮喘模型組為85.37±4.06％，哮喘模型組比正常對(duì)照組CD80的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；VitD3組為68.71±8.72％，免疫治療組為75.27±5.13％，聯(lián)合處理組為64.46±2.75％，VitD3組和免疫治療組中CD80比哮喘模型組表達(dá)均有降低，但無(wú)顯著降低(P>0.05)，只有聯(lián)合治療組比哮喘模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 脾源性DCs表面共刺激分子CD86，在正常對(duì)照組為7

24、0.41±7.23％，哮喘模型組為80.72±9.47％，哮喘模型組比正常對(duì)照組CD80的表達(dá)無(wú)顯著上調(diào)(P>0.05)；VitD3組為57.82±6.21％，免疫治療組為64.75±4.28％，聯(lián)合處理組為50.14±3.51，VitD3組和免疫治療組中CD86表達(dá)比哮喘模型組均有降低，但無(wú)顯著降低(P>0.05)，只有聯(lián)合治療組比哮喘模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 6.脾源性CD4+CD25+Foxp3+T：檢測(cè)脾源

25、性CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T細(xì)胞的百分比值，正常對(duì)照組為5.45±0.63％，哮喘模型組為3.61±0.47％，哮喘模型組比正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；VitD3組和免疫治療組均較哮喘組百分比值上升，但均無(wú)顯著增加(P>0.05)；聯(lián)合處理組百分比值為5.22±0.53％，較哮喘組顯著增高(P<0.05)。
　　 7.骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞中Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表達(dá)
　　

26、 不加VitD3，只常規(guī)使用rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)小鼠BMDCs，經(jīng)OVA和LPS進(jìn)行誘導(dǎo)48h之后，檢測(cè)Jagged1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：OVA組、LPS組比對(duì)照組Jagged1的mRNA表達(dá)均有增加，但無(wú)顯著性差別(P>0.05)，OVA+LPS組比對(duì)照組Jagged1的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與Jagged1的表達(dá)相似，在OVA組、LPS組比對(duì)照組，Jagged2的mRNA表達(dá)均有增加，但無(wú)顯著性

27、差別(P>0.05)，OVA+LPS組比對(duì)照組Jagged2的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。
　　 加用VitD3與rmGM-CSF、rmIL-4共同誘導(dǎo)的小鼠BMDCs，經(jīng)OVA和LPS進(jìn)行誘導(dǎo)48 h之后，檢測(cè)Jagged1和Jagged2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，OVA組、LPS組和OVA+LPS組與對(duì)照組相比，均略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 在無(wú)VitD3處理后的BMDCs在使用OVA刺激時(shí)，在15

28、0KDa和130KDa處分別可見(jiàn)Jagged1、Jagged2蛋白表達(dá)條帶，兩組比和對(duì)照組表達(dá)量略有增多，OVA+LPS組Jagged1和Jagged2蛋白表達(dá)明顯增加；加用VitD3后，OVA組、LPS組和OVA+LPS組Jagged1和Jagged2蛋白表達(dá)和對(duì)照組PBS刺激相比，均無(wú)明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.在小鼠OVA致敏哮喘模型中，使用VitD3預(yù)處理能夠增強(qiáng)SIT的治療作用，表現(xiàn)為減輕哮喘氣道的炎癥

29、，糾正Th1/Th2偏移，使脾源性DCs共刺激分子CD80、CD86表達(dá)降低以及誘導(dǎo)Tregs增加。
　　 2.在使用VitD3聯(lián)合rmIL-4，rmGM-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠髓源性DCs后，加用OVA，LPS刺激，可明顯降低DCs表面Notch配體Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表達(dá)。Jaagged1和Jagged2表達(dá)的降低，可能是VitD3參與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制之一。
　　 本文的結(jié)果證明，使用VitD3處