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文檔簡介
1、背景與目的:EB病毒(EBV)是一種在人類普遍流行的γ-皰疹病毒,與許多人類腫瘤如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關。其中EBV潛伏膜蛋白1(LMPl)被公認為病毒基因組編碼的唯一具有促細胞轉化作用的瘤蛋白,在鼻咽癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。LMP1的羧基末端(aa187~386)是LMP1致瘤作用的主要部位,包括3個活化區(qū)域(CTAR):即CTARl(194~231aa)、CTAR2(TRADD結合區(qū)351
2、~386aa)與CTAR3(275~330aa)。研究表明,LMP1能持續(xù)活化NF-kB,AP-1,JAKs/STATs并通過這些分子激活下游信號傳導通路而產(chǎn)生致瘤效應。由于蛋白質磷酸化是信號傳導通路中最廣泛最重要的翻譯后修飾,而且這些通路中的許多信號分子及其磷酸化狀態(tài)還遠遠沒有闡明。因此,為了全面了解、驗證LMP1介導的信號通路,闡明CTAR1、CTAR2與CTAR3在LMP1促鼻咽上皮細胞轉化成瘤中所涉及的信號網(wǎng)絡分子,本研究擬采用
3、磷酸化蛋白質組學方法分離和鑒定LMP1轉化的鼻咽上皮細胞的差異磷酸化蛋白,為EB病毒在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制提供進一步證據(jù)。 方法:采用脂質體轉染法將野生型LMP1、2個突變型LMP1(TRADD位點突變和aa232~35 1缺失)的逆病毒載體pLNSX-LMP1 WT、pLNSX-LMP1TRADD與pLNSX-LMP 1△232-351(以pLNSX為對照)分別導入PA317包裝細胞,G418篩選2周后擴大培養(yǎng),自細胞
4、培養(yǎng)上清獲得后續(xù)實驗所需的感染性逆病毒RV-pLNSX、RV-LMP1WT、RV-LMP1TRADD與RV-LMP1Δ232-351。然后,用濃縮的病毒分別感染人鼻咽上皮細胞NP69,匯合克隆培養(yǎng),獲得NP69-pLNSX 、 NP69-LMPWT 、 NP69-LMP1 TRADD 與NP69-LMP1Δ232-3514種轉化細胞系。觀察和檢測以上轉化細胞的形態(tài)、生長曲線、平板克隆、細胞周期等。同時,采用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術結
5、合Westem Blot方法分析NP69-pLNSx、NP69-LMP1WT、NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1Δ232-351細胞系磷酸化蛋白質表達的差異,即在感染24小時后抽提細胞總蛋白,2-DE分別分離NP69-pLNSX、NP69-LMP1WT、NP69-LMP 1TRADD與NP69-LMP 1 Δ232-35 1細胞的總蛋白質,每組平行進行兩塊膠電泳,其中一塊作為制備膠,另一塊作為分析膠。制備膠考染顯色,得到了
6、分辨率較高、重復性較好的NP69-pLNSX、NP69-LMP1WT、NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1Δ232-351細胞總蛋白質2-D膠電泳圖譜;分析膠中的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜后,與抗酪氨酸磷酸化抗體孵育,進行WestemBlot分析,獲得差異表達酪氨酸磷酸化蛋白質的反應圖譜;將制備膠的電泳圖譜和Westem Blot的反應圖譜進行比對分析,在制備膠上找到相應的差異酪氨酸磷酸化蛋白質點。利用MALDI-TOF-MS
7、對差異酪氨酸磷酸化蛋白質進行鑒定,部分差異蛋白質應用免疫沉淀方法進行驗證。 結果: (1)NP69-LMP1 WT細胞在培養(yǎng)過程中,逐漸由多角形、鵝卵石樣典型上皮形態(tài)演變成細胞間接觸減少的長梭狀纖維細胞樣形態(tài),而NP69-LMP1TRADD與NP69-LMP1△232-351細胞呈近乎多角形,比較接近NP69-pLNSX細胞形態(tài);NP69-LMP1WT細胞的生長速度、S期細胞所占比例比NP69-LMP1TRADD與NP6
8、9-LMP1Δ232-351及載體對照組NP69-pLNSX細胞明顯增加。 (2)在NP69-pLNSX與NP69-LMP1WT細胞比較組鑒定了12種差異表達的磷酸化蛋白質(上調(diào)有HSP27、波形蛋白等,下調(diào)有膜聯(lián)蛋白A1、GTP結合蛋白等),在NP69-LMP1WT與NP69-LMP1TRADD細胞比較組鑒定了11種差異表達的磷酸化蛋白質,在NP69-LMP1WT與NP69-LMP1Δ232-351細胞比較鑒定了10種差異表達
9、的磷酸化蛋白質。其中大部分是與細胞結構、信號傳導和轉錄翻譯相關的蛋白。 (3)在這些差異蛋白質中,有10種磷酸化蛋白質體現(xiàn)了LMP1羧基端各功能區(qū)的特異性,如HSP27在NP69-LMPlWT與NP69-LMP1TRADD細胞表達增加(與NP69-pLNSX細胞比較),在NP69-LMP1Δ232-351細胞卻不增加等。 (4)免疫沉淀驗證了4種蛋白在轉化細胞蛋白磷酸化表達水平的差異,結果與蛋白質組學結果一致。
10、結論: (1)LMP1可能通過上調(diào)HSP27、波形蛋白、角蛋白等,下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1、GTP結合蛋白,分子伴侶TCP1等多種蛋白的磷酸化促進NP69細胞轉化。 (2)CTAR2可能介導LMP1對波形蛋白,ER-60,HSP70等蛋白磷酸化的上調(diào)和膜聯(lián)蛋白A1,磷脂酰乙醇胺結合蛋白,蛋白酶體等蛋白磷酸化的下調(diào)而產(chǎn)生致瘤作用。 (3)CTAR3可能介導LMP1對ER-60,角蛋白8,HSP27等蛋白磷酸化的上調(diào)和磷脂酰
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