小麥CIPK基因家族鑒定與分析.pdf

1、干旱、高鹽、低溫等不利環(huán)境因素嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育。為應(yīng)對這些不利環(huán)境因素，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列響應(yīng)機(jī)制，其中鈣離子作為第二信使，在植物響應(yīng)非生物逆境脅迫的信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。鈣調(diào)磷酸酶-B類似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)是植物特有鈣離子識別受體蛋白，通過與其互作的激酶蛋白(CBL-interacting protein kinase,CIPK)作用激活后者，進(jìn)而磷酸

2、化修飾下游靶分子，啟動下游一系列響應(yīng)機(jī)制。在模式植物擬南芥中，有關(guān)CIPK在響應(yīng)非生物逆境脅迫中功能的研究報(bào)道較多。然而，在重要的糧食作物小麥中，關(guān)于CIPK基因的鑒定工作進(jìn)展緩慢，功能分析也少有報(bào)道。小麥具有異源六倍體基因組，其基因組相對于二倍體植物更加龐大、復(fù)雜。雖然目前小麥基因組測序工作取得了重大進(jìn)展，但是還不能提供完整的小麥基因組序列和物理圖譜。本研究采用了多種分析方法，對小麥CIPK全基因家族進(jìn)行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)79個(gè)TaCIP

3、K基因，歸屬為29個(gè)基因簇，并最終從這些基因簇中克隆到20個(gè)代表性的基因。在此基礎(chǔ)上，我們系統(tǒng)分析了CIPK基因的組織特異性、逆境響應(yīng)表達(dá)譜；研究了TaCIPK與TaCBL的相互作用關(guān)系；分析了TaCIPK24在轉(zhuǎn)基因擬南芥中對高鹽脅迫響應(yīng)中的作用；利用基因槍法獲得過表達(dá) TaCIPK10和TaCIPK10-RNAi的轉(zhuǎn)基因小麥植株；并利用生物信息學(xué)方法對小麥CIPK在種子萌發(fā)和成熟花粉中的功能進(jìn)行預(yù)測。
　　本研究主要內(nèi)容包括：

4、⑴利用生物信息學(xué)方法在小麥基因組中成功鑒定了79個(gè)TaCIPK基因，將其分為29個(gè)基因簇，每個(gè)基因簇中的基因?yàn)楫愒椿蚪M染色體上的等位基因，序列高度相似?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，42個(gè) TaCIPK基因可以鑒定到完整的結(jié)構(gòu)信息，其中23個(gè)基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，3個(gè)基因含有一個(gè)內(nèi)含子，其余16個(gè)基因含有5-14個(gè)內(nèi)含子。通過比較烏拉爾圖小麥、粗山羊草與小麥相對應(yīng)的亞基因組CIPK基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的CIPK基因序列區(qū)域間存在高度相似性，

5、但也有一定的差異，現(xiàn)階段的小麥基因組數(shù)據(jù)還不能確定 CIPK基因家族在六倍體化過程中是否發(fā)生了基因丟失或復(fù)制現(xiàn)象。根據(jù)EST拼接結(jié)果和基因組中CIPK的序列，設(shè)計(jì)特異引物，從小麥中共克隆出20個(gè)TaCIPK基因。⑵利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了17個(gè)TaCIPK基因在10種小麥組織中的表達(dá)情況；鑒定了23個(gè)TaCIPK基因?qū)?yīng)的探針，并利用R語言從公布的小麥基因芯片數(shù)據(jù)中分析這23個(gè)TaCIPK基因在7種組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，T

6、aCIPK家族基因在各個(gè)組織或時(shí)期中的表達(dá)量有所不同，反映了它們可能廣泛參與了小麥的生長發(fā)育過程。利用基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析了23個(gè)TaCIPK基因在種子萌發(fā)過程的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)8個(gè)TaCIPK基因在種子萌發(fā)過程表達(dá)量有顯著變化，進(jìn)一步利用半定量RT-PCR技術(shù)對這一結(jié)果進(jìn)行了確證。在花粉發(fā)育過程中，不同TaCIPK基因的表達(dá)模式也存在較大差異，其中6個(gè) TaCIPK基因只在成熟花粉中有高量表達(dá)，暗示它們可能在花粉萌發(fā)或者花粉管伸長

7、過程中發(fā)揮功能。利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了17個(gè)TaCIPK基因在ABA，GA，MeJA，ACC，低溫，PEG，H2O2，NaCl和高溫處理后小麥根和葉中的表達(dá)模式，并隨機(jī)選取5個(gè)基因（TaCIPK7，TaCIPK15，TaCIPK24，TaCIPK31和TaCIPK32），利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法分析了它們響應(yīng)ABA，PEG，低溫，H2O2和NaCl處理的表達(dá)模式。結(jié)果表明，不同的TaCIPK基因可以不同程度地對激素信號和

8、非生物逆境脅迫進(jìn)行響應(yīng)。⑶利用酵母雙雜交方法分析鑒定了7個(gè)TaCBL與20個(gè)TaCIPK蛋白相互作用模式，從中隨機(jī)選擇了7個(gè)組合利用雙分子熒光互補(bǔ)法在煙草表皮細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。將TaCIPK11蛋白C-端序列進(jìn)行系列刪除（保留NAF結(jié)構(gòu)域），結(jié)果顯示，刪除突變體與TaCBL的結(jié)合模式發(fā)生變化，說明TaCIPK蛋白C-端除NAF模體外的序列也對與TaCBL的結(jié)合發(fā)揮作用。我們認(rèn)為這些側(cè)翼序列主要是通過改變C-端空間構(gòu)象影響與TaCBL的結(jié)合

9、，并提出了CBL-CIPK結(jié)合的“凹凸”模型。根據(jù)此模型推斷，小麥亞基因組上TaCIPK等位基因在C-端的序列的變異可能導(dǎo)致與TaCBL的結(jié)合的改變，并利用TaCIPK17-A和TaCIPK-17B1分別與TaCBL的相互作用驗(yàn)證了這一推論。這些結(jié)果說明小麥CBL-CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，為CBL與CIPK的結(jié)合機(jī)制研究提供了參考。⑷發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)TaCIPK24可以增強(qiáng)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的耐受能力。測量了鹽處理后擬南芥

10、植株中Na+和K+含量，結(jié)果顯示，K+含量在轉(zhuǎn)基因和對照組中沒有明顯差異，而轉(zhuǎn)基因植株明顯比對照積累更少的Na+。TaCIPK24可能是通過激活擬南芥的SOS途徑，促進(jìn)排出更多的Na+從而減少過量 Na+對擬南芥植株造成的損害。我們發(fā)現(xiàn)與對照相比，TaCIPK24過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥可以積累更少的活性氧物質(zhì)。進(jìn)一步測定過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活力的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株可能還激活了過氧化物清除系統(tǒng)，從而降低高鹽脅迫造成的

11、氧化損傷。⑸利用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析法，構(gòu)建了小麥種子萌發(fā)和花粉發(fā)育過程中TaCIPK基因相關(guān)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)?；蚬δ芨患治鼋Y(jié)果顯示，8個(gè)TaCIPK基因在種子萌發(fā)時(shí)期參與到了碳水化合物代謝、脂類代謝和核小體組裝等過程；6個(gè)在成熟花粉中特異性高量表達(dá)的TaCIPK基因參與到了應(yīng)激反應(yīng)、糖代謝、氮代謝、電子傳遞和離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程。⑹組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TaCIPK10基因在葉片中的表達(dá)量明顯高于其它組織，使用皮爾森相關(guān)系數(shù)法篩選到的65個(gè)基因與T

12、aCIPK10表現(xiàn)出相同的表達(dá)模式；沒有發(fā)現(xiàn)除TaCIPK10基因外的其它TaCIPK基因與TaCIPK10有相似表達(dá)模式，且其它CIPK基因存在功能互補(bǔ)的可能性較小，暗示著TaCIPK10可能發(fā)揮著比較特殊的功能。此外我們發(fā)現(xiàn) TaCIPK10可以被多種激素和非生物逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。為研究TaCIPK10的功能，我們構(gòu)建了TaCIPK10過表達(dá)和TaCIPK10-RNAi載體，利用基因槍法轉(zhuǎn)化中國春小麥，獲得了8個(gè)TaCIPK10過表