小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因家族的分子鑒定與生理功能研究.pdf

1、在正常的有氧代謝、應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫以及病菌侵害時(shí)細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，可以對(duì)DNA，蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等生物大分子造成不利影響并可能最終導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷。盡管大部分生物在進(jìn)化過(guò)程中形成了酶和非酶清除系統(tǒng)來(lái)清除ROS，但仍有部分ROS能夠逃脫清除，導(dǎo)致生物大分子的氧化。蛋白質(zhì)中的許多氨基酸殘基，尤其是含硫氨基酸——半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)非常易于被ROS氧化。ROS介導(dǎo)的氧化會(huì)使Met形成S-和R-兩種差向異構(gòu)體的甲硫氨

2、酸亞砜(MetSO)，導(dǎo)致許多蛋白的活性和結(jié)構(gòu)的改變，然而這種改變可以被甲硫氨酸亞砜還原酶(MSR)逆轉(zhuǎn)。MSR主要有兩種類(lèi)型，MSRA和MSRB，分別特異性作用于S-和R-型MetSO異構(gòu)體。MSRA和MSRB已經(jīng)在包括細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物和植物等在內(nèi)的大部分生物有機(jī)體中得到了鑒定。植物中存在龐大的MSR基因家族，例如，在擬南芥中存在5個(gè)MSRA和9個(gè)MSRB同源基因，在水稻中也至少存在4個(gè)MSRA和3個(gè)MSRB?；虻亩嗫截惣熬哂胁?/p>

3、同的亞細(xì)胞定位使MSR在植物中可能起到了更多更復(fù)雜的作用。
　　 小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，其生長(zhǎng)和產(chǎn)量受到干旱、鹽堿、極端溫度等多種非生物脅迫的嚴(yán)重影響，因此提高小麥的耐逆性是提高其產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑。本實(shí)驗(yàn)室利用不對(duì)稱(chēng)體細(xì)胞雜交創(chuàng)制漸滲系新技術(shù)，獲得了普通小麥濟(jì)南177(JN177)與近緣屬長(zhǎng)穗偃麥草(Ae)的小麥漸滲系耐鹽新品種山融3號(hào)(SR3)，并利用抑制性差減雜交技術(shù)(suppressivesubtractiv

4、ehybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了山融3號(hào)和濟(jì)南177鹽脅迫響應(yīng)的SSHcDNA文庫(kù)，為挖掘小麥的耐逆基因提供了平臺(tái)。
　　 MSR在植物耐逆方面的研究已經(jīng)在擬南芥及水稻中開(kāi)展，但是對(duì)于小麥中MSR的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本論文首先利用擬南芥和水稻的MSR基因?qū)CBI網(wǎng)站上已經(jīng)發(fā)布的小麥全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行Blast分析，初步搜索找到了8個(gè)小麥同源基因。對(duì)這8個(gè)基因序列編碼的蛋白產(chǎn)物在生物信息學(xué)方面進(jìn)行了詳細(xì)的分析，

5、發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)與AtMSRA4高度同源，具有MSRA的保守結(jié)構(gòu)域因此命名為T(mén)aMSRA4，其余7個(gè)與AtMSRB-同源，具有MSRB的保守結(jié)構(gòu)域，并分屬于3個(gè)不同的亞家族，分別為T(mén)aMSRB1亞家族，包括TaMSRB1.1和TaMSRB1.2，TaMSRB2亞家族，包括TaMSRB2.1、TaMSRB2.2和TaMSRB2.3，以及TaMSRB3業(yè)家族，包括TaMSRB3.1和TaMSRB3.2。它們與同源的擬南芥和水稻的MSR在保守結(jié)構(gòu)

6、域中有著高度的相似性，并且同一亞家族成員間的序列是高度保守的，有的只有幾個(gè)氨基酸的差別。軟件預(yù)測(cè)它們編碼的蛋白質(zhì)有兩種亞細(xì)胞定位方式，TaMSRB2亞家族成員定位在胞質(zhì)中，而TaMSRA4，TaMSRB1亞家族和TaMSRB3亞家族成員均定位在葉綠體中，這一結(jié)果與它們的同源AtMSR存在個(gè)別差異。為了探索小麥MSR基因在抗逆方面的功能，本論文選擇了兩個(gè)分屬于不同亞家族的基因TaMSRB2.1和TaMSRB3.1進(jìn)行了深入的研究，其中Ta

7、MSRB2.1在本實(shí)驗(yàn)室的山融3號(hào)和親本JN177在NaCl和PEG脅迫下基因差異表達(dá)的芯片結(jié)果中還表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化。RT-PCR分析結(jié)果表明在NaCl、PEG處理下兩個(gè)基因均出現(xiàn)了短暫上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，兩個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)模式也存在差異。從山融3號(hào)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了克隆，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明它們的實(shí)際定位結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)一致。分別構(gòu)建兩個(gè)基因的過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，之后進(jìn)行了多種處理下的擬南芥

8、根長(zhǎng)表型實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TaMSRB2.1的轉(zhuǎn)基因株系在NaCl和甘露醇處理下與野生型相比表現(xiàn)出了明顯的根長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明TaMSRB2.1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對(duì)鹽、旱的耐受性，而在H2O2和ABA等處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異;TaMSRB3.1的過(guò)表達(dá)株系在NaCl、H2O2、ABA以及高濃度的甘露醇處理下根長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)顯著，在控水實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)TaMSRB3.1使擬南芥的存活率提高。研究結(jié)果表明了TaMSRB2.1和T