甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因的克隆與鑒定.pdf

1、甘蔗（Saccharum officinarum）是最主要的糖料作物，而甘蔗黑穗?。⊿porisorium scitamineu）是我國(guó)蔗區(qū)最嚴(yán)重的一種氣傳真菌病害，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量和糖分產(chǎn)量。目前普遍認(rèn)為，以甘蔗抗黑穗病品種取代感病品種是防治黑穗病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。但是，由于甘蔗遺傳背景復(fù)雜，甘蔗優(yōu)良基因型重組概率低至1/300,000，單純依靠傳統(tǒng)雜交和系圃選擇的途徑來(lái)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病兼具的優(yōu)良品種難度大。通過(guò)挖掘甘蔗抗病基因，

2、一方面可以為轉(zhuǎn)基因改良提供優(yōu)異基因資源，另一方面還可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抗病標(biāo)記輔助選擇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。植物幾丁質(zhì)酶（Chitinase）是一種典型的病程相關(guān)蛋白，已經(jīng)成為作物抗真菌病害的研究熱點(diǎn)之一。它能夠降解真菌細(xì)胞壁的重要成分—幾丁質(zhì)，抑制真菌生長(zhǎng)，從而提高植物對(duì)病原真菌的防御能力。鑒于此，進(jìn)行甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因的分離與鑒定對(duì)甘蔗抗真菌性病害的聚合育種具有重要意義。
　　本研究通過(guò)同源克隆法，從甘蔗中分離獲得4個(gè)幾丁質(zhì)酶家族基因的

3、全長(zhǎng)cDNA序列。而后，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，對(duì)基因所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了甘蔗幾丁質(zhì)酶基因在甘蔗上的組織表達(dá)特性及其響應(yīng)甘蔗黑穗病病原菌、信號(hào)因子和環(huán)境脅迫的表達(dá)模式。并進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將幾丁質(zhì)酶基因?qū)肽Ｊ街参餆煵荩∟icotiana tabacum）中，研究基因過(guò)表達(dá)的效應(yīng)。研究結(jié)果為揭示甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因的功能鑒定及及在甘蔗抗逆育種上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果與結(jié)

4、論如下：
　　1.甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆與分析
　　采用同源克隆法，根據(jù)高粱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的假定幾丁質(zhì)酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得4個(gè)甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因cDNA序列，其中3個(gè)以甘蔗基因型崖城05-179接種黑穗病菌后48h樣品為模板獲得的，命名為：ScChiⅣ1、ScChiⅦ1和ScChiⅦ2，序列長(zhǎng)度依次為：906bp、907bp和1,005bp，ORF分別為813bp、9

5、00bp和990bp。GenBank登錄號(hào)分別為：KF664178、KF279662和KF664179；以崖城05-179組培苗4℃處理24h后的樣品為模板，克隆獲得1個(gè)幾丁質(zhì)酶家族基因，命名為ScChiⅠ1，長(zhǎng)度1,085bp，ORF為978bp，GenBank登錄號(hào)為KF664182。序列分析表明，上述4個(gè)基因序列的一致性介于22.7％-62.5%之間，其編碼蛋白與其他植物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性較高，分別屬于幾丁質(zhì)酶家族Cl

6、assⅠ、ClassⅣ和ClassⅦ（ScChiⅦ1和ScChiⅦ2）。3個(gè)類型的幾丁質(zhì)酶基因在核苷酸、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域上存在顯著差異。
　　2.甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)模式分析
　　熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，4個(gè)甘蔗幾丁質(zhì)酶基因在蔗芽、葉、蔗髓和蔗皮中均有表達(dá)，屬組成型表達(dá)，但ScChiⅠ1在葉和蔗皮中表達(dá)量最高，ScChiⅣ1在葉中表達(dá)量最高，ScChiⅦ1和ScChiⅦ2在蔗芽中表達(dá)量最高。所克隆的4個(gè)ScChi對(duì)甘蔗黑穗

7、病菌脅迫響應(yīng)的表達(dá)模式存在甘蔗基因型差異，其中ScChiⅠ1和ScChiⅦ1在抗病和感病基因型中表現(xiàn)一致。表現(xiàn)在：在抗病基因型崖城05-179中，ScChiⅠ1的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，但ScChiⅣ1、ScChiⅦ1和ScChiⅦ2的轉(zhuǎn)錄水平卻呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)，說(shuō)明ScChiⅠ1正響應(yīng)黑穗病菌脅迫，但其余3個(gè)基因則為負(fù)響應(yīng)；在基因型―ROC22中，接種后24h，ScChiⅠ1、ScChiⅣ1和ScChiⅦ2的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，

8、但ScChiⅦ1轉(zhuǎn)錄水平則明顯下降，說(shuō)明ScChiⅠ1在感病基因型中也正響應(yīng)黑穗病菌脅迫，而ScChiⅦ1依然為負(fù)響應(yīng)。甘蔗幾丁質(zhì)酶基因?qū)π盘?hào)物質(zhì)（水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸）和環(huán)境（干旱、NaCl、重金屬和低溫）脅迫的應(yīng)答反應(yīng)不同。受水楊酸（Salicylic acid,SA）、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate,MeJA）、脫落酸（Abacisic acid,ABA）脅迫后，ScChiⅠ1轉(zhuǎn)錄本水平均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)；Sc

9、ChiⅣ1基因表達(dá)受MeJA和ABA顯著誘導(dǎo)，但受SA的顯著抑制；受ABA脅迫后，ScChiⅦ1轉(zhuǎn)錄本水平呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，受MeJA和SA脅迫后，ScChiⅦ1表達(dá)水平呈現(xiàn)下降的水平；受SA、MeJA、ABA脅迫后，ScChiⅦ2轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降，并呈現(xiàn)全程抑制趨勢(shì)。受干旱（PEG）、NaCl和重金屬（CuCl2）脅迫后，ScChiⅠ1轉(zhuǎn)錄本水平呈現(xiàn)顯著上升，但低溫（4℃）卻抑制ScChiⅠ1的轉(zhuǎn)錄；上述環(huán)境脅迫顯著提高了ScChiⅣ

10、1基因的轉(zhuǎn)錄，且呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)；除低溫（4℃）外，ScChiⅦ1的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；除NaCl脅迫外，在脅迫后24h，ScChiⅦ2的表達(dá)量明顯提高。上述結(jié)果說(shuō)明，甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因具有多樣性的功能。
　　3.亞細(xì)胞定位分析
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將帶有不同目的基因ScChi（ScChiⅠ1、ScChiⅣ1或ScChiⅦ2）的植物亞細(xì)胞定位載體質(zhì)粒pCAMBIA-2300-ScChi-GFP滲透導(dǎo)入煙草葉片，顯微鏡

11、下觀察到pCAMBIA-2300-ScChiⅦ2-GFP重組蛋白的熒光信號(hào)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。
　　4.ScChiⅠ1基因的原核表達(dá)分析
　　成功構(gòu)建了帶有ScChiⅠ1基因的原核表達(dá)載體pET32a-ScChiⅠ1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌（E. coli）表達(dá)菌株BL21細(xì)胞中，得到目的融合蛋白，分子量為52.5kDa，為該基因編碼蛋白的體外抑菌活性驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。
　　5.ScChiⅦ2基因瞬時(shí)表達(dá)分析

12、　　構(gòu)建了植物超表達(dá)載體pCAMBIA-1301-ScChiⅦ2，其在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）染色顏色加深和電導(dǎo)率增加，表明H2O2的積累，說(shuō)明ScChiⅦ2引起植物過(guò)敏反應(yīng)。
　　6.甘蔗幾丁質(zhì)酶基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草研究
　　構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA-1301-ScChiⅠ1/ScChiⅣ1/ScChiⅦ2，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草的葉盤(pán)，獲得18株P(guān)CR檢