版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的:克隆并鑒定鼠HMGB1基因;原核表達(dá)HMGB1蛋白,制備多克隆抗體;檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中高遷移率族蛋白1(highmobility group box chromosomal protein1,HMGB1)及Th17主要轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,分析HMGB1、Th17細(xì)胞相關(guān)因子及某些臨床檢驗(yàn)指標(biāo)之間的相關(guān)性;通過(guò)體外HMGB1對(duì)Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用,初步探討HMGB1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中可能的作用機(jī)制。
2、> 方法:
1)采用RT-PCR方法從小鼠脾臟細(xì)胞獲得HMGB1基因全長(zhǎng),克隆至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌,挑取菌落進(jìn)行進(jìn)行單、雙酶切鑒定及序列分析。
2)將HMGB1基因克隆到pET28原核表達(dá)載體,在大腸埃希菌Rossta中表達(dá),獲得帶有His標(biāo)簽的30KD左右的HMGB1融合蛋白;利用Bio-Rad公司的IMAC柱純化HMGB1蛋白;用抗-His抗體對(duì)HMGB1融合蛋白進(jìn)
3、行Westernblot鑒定。以HMGB1蛋白作為抗原免疫家兔,收集含抗HMGB1多克隆抗體的兔血清,并用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法鑒定抗體的效價(jià)。
3)收集江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院-鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院門(mén)診80例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血標(biāo)本,其中靜止期32例、活動(dòng)期48例,健康志愿者50例。
4)HMGB1與小鼠CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)。
5)采用實(shí)時(shí)熒
4、光定量PCR(QRT-PCR)及ELISA檢測(cè)標(biāo)本PBMC中HMGB1及Th17相關(guān)因子的表達(dá)水平。
6)采用流式分析(FACS)法檢測(cè)標(biāo)本中CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的比率。
結(jié)果:
1.鼠HMGB1基因克隆,表達(dá)及多克隆抗體制備結(jié)果
1)成功克隆了包括648bp編碼區(qū)的鼠HMGB1基因全長(zhǎng),與Genebank中發(fā)表的序列完全一致。
2)在大腸埃希菌經(jīng)誘導(dǎo)和純
5、化獲得HMGB1融合蛋白,大小約為30KD。
3)成功制備了針對(duì)鼠HMGB1蛋白的多克隆抗體,經(jīng)ELISA和Western blot鑒定,具有良好的反應(yīng)性,也表明融合蛋白具有良好的免疫原性。
2.RA病人相關(guān)檢測(cè)分析結(jié)果
1)QRT-PCR分析結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組比較,RA患者組PBMC中HMGB1及Th17細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子RORrγt和相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P
6、<0.05);活動(dòng)期RA患者高于靜止期患者表達(dá)水平(P<0.05)。相關(guān)性分析表明,RA患者HMGB1與Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平有明顯相關(guān)性。
2)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:RA患者血漿IL-17、IL-23呈高表達(dá),與健康對(duì)照組差異明顯(P<0.05)。
3)流式分析結(jié)果顯示:RA患者CD3+CD8-IL17+T細(xì)胞比率部分明顯高于健康對(duì)照組。
3.HMGB1體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果<
7、br> HMGB1刺激小鼠CD4+T細(xì)胞結(jié)果顯示:HMGB1對(duì)Th17的誘導(dǎo)呈現(xiàn)時(shí)間劑量效應(yīng),在濃度為100ng/ml作用12h對(duì)Th17細(xì)胞有最佳的誘導(dǎo)效果。
結(jié)論:
獲得了鼠HMGB1基因克隆并制備和純化了鼠HMGB1蛋白及多克隆抗體;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PBMC中HMGB1和Th17細(xì)胞的表達(dá)水平高于健康者,且RA患者HMGB1的表達(dá)與Th17細(xì)胞相關(guān)因子及臨床檢測(cè)指標(biāo)的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān),說(shuō)明HMG
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- Th17細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的表達(dá)及臨床意義.pdf
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平及其臨床相關(guān)性.pdf
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的康復(fù)
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎課件
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎ra
- 兒童類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療
- 1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎ra
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的護(hù)理
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的健康宣教
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎定稿ppt
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎健康教育
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎教學(xué)目標(biāo)
- Ndrg2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用初步研究.pdf
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎護(hù)理常規(guī)
- 什么是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影像診斷
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論