應(yīng)用全血細(xì)胞因子譜評估腎移植受者免疫狀態(tài).pdf

1、研究背景：
　　 腎移植是治療終末期腎臟疾病的重要方法。由于腎臟供體是受者同種異體抗原的持續(xù)來源,排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后造成移植腎損傷的最直接和最重要的因?yàn)?是移植成敗的最主要因?yàn)?因此,抗排斥治療同腎臟供體一樣將與受者相伴。為了預(yù)防和治療排斥反應(yīng),環(huán)孢素(CsA),FK506、驍悉(MMF)等小分子藥物以及抗CD3、抗CD25等抗體類免疫抑制劑相繼問世,極大提高了移植成功率,大大促進(jìn)了移植學(xué)的發(fā)展。然而,抗排斥藥是把雙刃劍,它可

2、以保護(hù)腎臟免受免疫損傷,同樣也可以導(dǎo)致嚴(yán)重感染而使患者死亡。因此,如何把握免疫抑制劑的用量,在排斥和感染之間找到平衡點(diǎn)是目前腎移植以及所有器官移植的重要難題。
　　 液態(tài)懸浮芯片技術(shù)為快速測定多種細(xì)胞因子提供了技術(shù)保障。由于體內(nèi)免疫細(xì)胞組成復(fù)雜以及功能狀態(tài)的不斷變化,測定單個(gè)細(xì)胞因子難以反映體內(nèi)免疫細(xì)胞的整體功能,因而快速、微量、多種細(xì)胞因子同時(shí)測定的方法才能保證我們對任何一個(gè)患者都可以獲得足夠的細(xì)胞因子信息用以進(jìn)行對比分析。由

3、Luminex公司開發(fā)的液態(tài)懸浮芯片技術(shù)可以快速、微量、敏感地檢測數(shù)十種細(xì)胞因子,是ELISA方法的替代產(chǎn)品。這一技術(shù)使得對檢測樣本進(jìn)行大規(guī)模定量分析成為可能。該技術(shù)獲得2005年臨床診斷領(lǐng)域技術(shù)革新頭獎(jiǎng)。而且Bio-rad公司對該技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn),如增加標(biāo)準(zhǔn)校正板,專用數(shù)據(jù)分析軟件等,大大提高了檢測范圍、靈敏度(從0.2pg到3200pg)和可靠性。同時(shí)該技術(shù)還開發(fā)出一種隨意組合技術(shù)(xplex)即檢測者可以依據(jù)自己檢測的需要對檢

4、測抗體進(jìn)行組合,從而檢測自己所需要的細(xì)胞因子。
　　 我們在前人研究探索的基礎(chǔ)上提出了應(yīng)用合適的免疫刺激劑活化外周全血免疫細(xì)胞,分析細(xì)胞因子的分泌情況,判斷患者免疫狀態(tài),以下是我們對該方法探索過程的總結(jié)。
　　 一 細(xì)胞因子譜評估免疫狀態(tài)所需參數(shù)的摸索
　　 能夠刺激外周全血分泌細(xì)胞因子的刺激劑較多,其中有絲分裂原(如PHA,ConA等)刺激能力較強(qiáng),可以使免疫細(xì)胞較為充分的活化。我們比較了常見免疫刺激劑及其組合

5、對外周全血刺激的效果,發(fā)現(xiàn)在相同的濃度下PHA刺激組大多數(shù)細(xì)胞因子濃度快速上升,并且高于其它免疫刺激劑或刺激劑組合組,因此,我們選擇PHA作為本研究的刺激劑。不同的PHA濃度刺激效果存在差異,但隨著PHA濃度的增大細(xì)胞因子濃度的增高潛力逐漸減小,因此,我們推測PHA刺激外周全血存在一個(gè)最佳濃度,即達(dá)到此濃度后繼續(xù)增加PHA劑量,細(xì)胞因子的分泌不會相應(yīng)增加,我們通過比較不同濃度PHA刺激外周全血的效果,發(fā)現(xiàn)10μg/ml的PHA刺激后細(xì)胞

6、因子濃度上升最快,濃度最高,因此,我們將10 μ g/ml作為本研究PHA的刺激濃度。PHA刺激外周血后細(xì)胞因子的濃度會逐漸上升,由于細(xì)胞的增殖需要消耗部分細(xì)胞因子,因此,細(xì)胞因子的分泌和消耗,應(yīng)該在刺激一定時(shí)間后達(dá)到動態(tài)平衡,我們比較了PHA刺激3h、6h、9h和12h的細(xì)胞因子分泌情況,盡管細(xì)胞因子濃度的變化各有特色,但大多數(shù)細(xì)胞因子在PHA刺激后6-12小時(shí)濃度達(dá)到峰值或平臺值,此時(shí),細(xì)胞因子的濃度相對穩(wěn)定,因此,我們選擇12小時(shí)

7、為本研究的最佳刺激時(shí)間。此外,為了明確非稀釋全血中的營養(yǎng)物質(zhì)能否滿足12小時(shí)培養(yǎng)的需要,我們還進(jìn)行了外周血培養(yǎng)后PBMCs(外周血單個(gè)核細(xì)胞)活力的檢測,將非稀釋的外周全血培養(yǎng)13小時(shí)后分離PBMCs,進(jìn)行流式檢測,發(fā)現(xiàn)PBMCs的存活率在90％以上,并且,刺激組和非刺激組結(jié)果一致。通過逐步摸索,我們確定將PHA作為本研究的免疫刺激劑,lOμg/ml作為本研究的PHA刺激濃度,12小時(shí)作為本研究的刺激時(shí)間。
　　 二 免疫抑制劑

8、對細(xì)胞因子譜的影響
　　 臨床常用免疫抑制劑主有神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(如環(huán)孢素A和FK506)、驍悉、糖皮質(zhì)激素(如甲強(qiáng)龍和強(qiáng)的松)等。不同免疫抑制劑的作用機(jī)制各不相同,它們作用于外周全血后對細(xì)胞因子分泌的影響也必定有所不同,為了明確這些常用免疫抑制劑對細(xì)胞因子分泌的影響,我們選取了FK506、MPA(驍悉的有效成分)和地塞米松(按照強(qiáng)的松和甲強(qiáng)龍的作用效能比換算)作為免疫抑制劑的代表,并選取臨床常用濃度進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。分別將上述免疫

9、抑制劑和PHA同時(shí)加入外周全血,培養(yǎng)12小時(shí),檢測全血中細(xì)胞因子的分泌情況,發(fā)現(xiàn)三種免疫抑制劑均可影響細(xì)胞因子的分泌,但受影響的細(xì)胞因子譜不同,地塞米松抑制譜較寬,可以顯著抑制大多數(shù)細(xì)胞因子的分泌,包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-17、IL-5、IL-10、IL-13、IL-1β和G-CSF(P值均小于0.05)。FK506抑制譜較窄,僅能抑制IL-2和IL-13的分泌(P值均小于O.05)。MPA抑制譜和FK506

10、相同,僅能抑制IL-2和IL-13(P值均小于0.05),但MPA可以顯著增加IL-1β的分泌(P<0.05),這是MPA所特有的,是驍悉作用的因子標(biāo)識。由此可見,免疫抑制劑可以影響細(xì)胞因子的分泌,并且具有特征性因子譜。
　　 不同劑量的免疫抑制劑可以造成機(jī)體不同的免疫狀態(tài),據(jù)此,我們推測不同濃度的免疫抑制劑對細(xì)胞因子分泌的影響程度也應(yīng)該不同,或者具有濃度依賴性,為了明確此推測,我們選擇DEX(地塞米松)、FK506和MPA分析

11、免疫抑制劑對細(xì)胞因子的作用是否具有濃度依賴性,我們將抑制劑濃度分為四個(gè)梯度作用于外周全血,與PHA同時(shí)加入外周全血,培養(yǎng)12小時(shí),觀察細(xì)胞因子的分泌情況,我們發(fā)現(xiàn)三種免疫抑制劑對細(xì)胞因子的作用均有濃度依賴性特點(diǎn)。因此,細(xì)胞因子檢測可以反映免疫抑制劑造成的不同免疫狀態(tài)。
　　 免疫抑制劑下調(diào)機(jī)體的免疫功能具有個(gè)體特異性,這種現(xiàn)象在臨床較為常見,相同血藥濃度的患者一些出現(xiàn)感染,而另外一些出現(xiàn)排斥反應(yīng),這是免疫抑制劑作用的個(gè)體差異所致

12、。免疫抑制劑作用外周全血后對細(xì)胞因子分泌的影響是否也有個(gè)體差異性,以及在同一個(gè)體重復(fù)同樣的操作所得結(jié)果是否可靠也不明確,為了了解個(gè)體間差異和和方法的可靠性,我們首先選擇了地塞米松進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DEX(地塞米松)對IL-5、IL-10和IL-13的抑制作用在3個(gè)健康志愿者之間存在差異(P值均小于0.05),在三名志愿者之間12種細(xì)胞因子的總體變異系數(shù)是23.95％±10.87％；在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中DEX對細(xì)胞因子的抑制作用沒有差異(P值均大

13、于O.05),在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中12種細(xì)胞因子的總體變異系數(shù)是16.05％±10.84％。由此可見,該檢測方法是可靠的,不同個(gè)體的外周全血對同種免疫抑制劑的反應(yīng)是存在差異的。
　　 由于機(jī)體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性,臨床常采取多種免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的方案進(jìn)行抗排斥治療,因此,了解多種免疫抑制劑聯(lián)合作用對外周血細(xì)胞因子分泌的影響顯得很有必要。為了明確細(xì)胞因子的分泌能否反映多種免疫抑制劑的作用,我們選取了FK506+DEX、FK506+MPA

14、以及FK506+DEX+MPA三種聯(lián)合方案,分別將相應(yīng)的免疫抑制劑和PHA同時(shí)加入外周全血,培養(yǎng)12小時(shí),觀察外周血細(xì)胞因子的分泌情況。我們發(fā)現(xiàn)多藥聯(lián)合后其作用可以保留單一藥物的作用特點(diǎn),并具有累加效應(yīng)。含有DEX的組合可以抑制大多數(shù)細(xì)胞因子(P值均小于O.05),含有MPA的組合可以顯著增加IL-1β的分泌(P　　 三 腎移植受者術(shù)后細(xì)胞因子譜的變化
　　

15、 檢測健康人細(xì)胞因子的體外實(shí)驗(yàn)表明該方法可以反映免疫抑制劑作用后的免疫細(xì)胞的功能狀態(tài),提示通過此方法可以評估器官移植患者術(shù)后機(jī)體的免疫狀態(tài)。器官移植患者由于服用多種免疫抑制劑,并且體內(nèi)長期帶有同種異體抗原,因此,體內(nèi)情況更為復(fù)雜,細(xì)胞因子能否反映臨床患者的真實(shí)免疫狀態(tài)尚難確定。為了明確此方法能否反映臨床患者的免疫狀態(tài)變化,我們精心挑選了兩例典型的腎移植患者進(jìn)行對比觀察,對細(xì)胞因子譜評估免疫狀態(tài)的方法進(jìn)行初步檢驗(yàn)。兩例患者中一例是二次移植

16、,PRA陽性,另一例是初次移植,PRA陰性,供腎來自同一供者。二次移植患者術(shù)后出現(xiàn)了排斥反應(yīng),再次出現(xiàn)肌酐升高和尿量減少；初次移植患者術(shù)后恢復(fù)良好,腎功能迅速恢復(fù)正常。二次移植患者在排斥反應(yīng)指征出現(xiàn)之前細(xì)胞因子分泌明顯高于初次移植患者,并且細(xì)胞因子的變化同臨床指征變化具有一致性。我們檢測了17種細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)IL-2,IL-4,IL-6,GM-CSF,IFN-γ,TNF-α的變化規(guī)律與排斥患者的臨床狀況的改變一致,并且比臨床癥狀更敏感和

17、有更好的時(shí)間優(yōu)勢；腎功能穩(wěn)定患者的多數(shù)細(xì)胞因子濃度一直保持在較低水平,其血藥濃度檢測也顯示濃度過高,兩者具有一定的相關(guān)性。由此可見,細(xì)胞因子檢測評估腎移植受者機(jī)體免疫狀態(tài)是可行的。為了進(jìn)一步評估和優(yōu)化該方法,還需要收集更多患者的臨床樣本,動態(tài)觀察細(xì)胞因子的分泌,通過多參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析準(zhǔn)確判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)。
　　 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
　　 1.目前,在世界范圍內(nèi)尚無確切可靠的方法來判斷患者的免疫狀態(tài),該項(xiàng)目的研究將填補(bǔ)此方面

18、的空白,面向臨床,服務(wù)患者。
　　 2.抓住器官移植受者免疫狀態(tài)這一主要矛盾,瞄準(zhǔn)免疫細(xì)胞活化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié),通過測定移植受者免疫細(xì)胞活化能力來判斷免疫系統(tǒng)功能,進(jìn)而為臨床合理應(yīng)用免疫抑制劑提供可靠數(shù)據(jù)。
　　 3.采用全血檢測,最大程度地保持了體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境,同時(shí)縮短檢測時(shí)間,滿足了臨床快速檢測的要求,適于推廣應(yīng)用。
　　 4.采用多細(xì)胞因子整體分析,綜合評估,更能反映體內(nèi)細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)的真實(shí)情況,更具有代