小鼠Graves病模型構(gòu)建及131I、抗ICAM-1單抗治療實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建BALB/c小鼠Graves病(Graves Disease，GD)模型，制備具有生物活性的抗細(xì)胞間黏附分子1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的單克隆抗體，研究131I及抗ICAM-1單抗對(duì)GD模型小鼠的治療效果。
　　 方法：⑴構(gòu)建BALB/c小鼠GD模型:通過(guò)對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腓腸肌注射重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TSHR268并在注射部位電穿孔進(jìn)行免疫。檢測(cè)小

2、鼠甲狀腺素(thyroxine，T4)、促甲狀腺素受體氨基端蛋白抗體(thyroid stimulating hormonereceptor N-terminal antibody, TRAb N)、促甲狀腺素受體羧基端蛋白抗體(thyroidstimulating hormone receptor C-terminal antibody, TRAbC)。對(duì)模型小鼠進(jìn)行99mTcO4-顯像及甲狀腺病理學(xué)分析，構(gòu)建GD動(dòng)物模型。⑵制備抗I

3、CAM-1單克隆抗體:用純品ICAM-1蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/O融合，將分泌陽(yáng)性細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，采用小鼠體內(nèi)誘生的方法大量制備單抗，純化腹水得到有生物活性的抗ICAM-1單克隆抗體。⑶使用131I及抗ICAM-1單克隆抗體對(duì)GD模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療:分別通過(guò)腹腔注射131I及抗ICAM-1單抗的方法治療GD模型小鼠，檢測(cè)小鼠血清T4、TRAbN抗體、TRAbC抗體水平，進(jìn)行99mTcO4-顯像及甲狀

4、腺病理學(xué)分析，將上述結(jié)果與對(duì)照組、空白組小鼠進(jìn)行比較，對(duì)131I及抗ICAM-1單抗治療GD模型小鼠的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：①通過(guò)腓腸肌注射重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TSHR268并在注射部位進(jìn)行電穿孔的方法可以成功構(gòu)建BALB/c小鼠GD模型，陽(yáng)性率為80％(24/30)。②24只成功建模的BALB/c小鼠T4、TRAb N抗體及TRAbC抗體平均水平均較免疫前明顯升高。停止免疫后，小鼠T4、TRAbN抗體及TRAb C

5、抗體平均水平有所下降，但仍明顯高于免疫前水平(P＜0.05)。對(duì)照組與空白組小鼠T4、TRAbN抗體及TRAbC抗體平均水平在免疫前后未見(jiàn)明顯變化。③經(jīng)過(guò)4次免疫，實(shí)驗(yàn)組小鼠甲狀腺對(duì)99mTcO4-的攝取能力較對(duì)照組及空白組明顯增強(qiáng)，對(duì)照組與空白組小鼠之間甲狀腺對(duì)99mTcO4-的攝取能力未見(jiàn)明顯差異。④GD模型小鼠甲狀腺較正常BALB/c小鼠體積增大。病理學(xué)檢查可見(jiàn)GD模型小鼠甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，甲狀腺濾泡內(nèi)膠質(zhì)稀薄、顏色變淡，部

6、分濾泡上皮細(xì)胞增生。⑤使用純品ICAM-1蛋白對(duì)BALB/c小鼠腹腔注射，免疫3次后可達(dá)到預(yù)期免疫效果。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫成功的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合可制備雜交瘤細(xì)胞。⑥192孔融合細(xì)胞中有174孔可見(jiàn)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，融合率為90.6％。其中抗體分泌陽(yáng)性細(xì)胞有13孔，陽(yáng)性率為7.5％。再次篩選陽(yáng)性孔為3孔，分別為C9、G10、H7。3株陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)2次克隆化培養(yǎng)后100％均為抗體分泌陽(yáng)性，且經(jīng)過(guò)檢測(cè)均為分泌IgG1型單抗。⑦BA

7、LB/c小鼠誘生腹水中單克隆抗體效價(jià)可達(dá)到1∶200000，而雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中單抗效價(jià)僅為1∶1000。⑧根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度各自對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吸光度繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式:y=0.0014x+0.011，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計(jì)算出C9、G10、H7蛋白濃度分別為917.8571μg/ml、650.0000μg/ml、767.8571μg/ml。⑨抗ICAM-1單抗治療組小鼠T4、TRAb N抗體及TRAbC抗體平均水平有不同程度下

8、降，其中TRAbC抗體濃度平均水平降至正常。⑩131I治療組小鼠T4、TRAbN抗體及TRAbC抗體平均水平均明顯下降，其中T4平均水平低于正常，小鼠出現(xiàn)甲減，而TRAbN抗體及TRAb C抗體平均水平均降至正常?？笽CAM-1單抗治療組小鼠甲狀腺對(duì)99mTcO4-的攝取能力較未經(jīng)治療的GD模型小鼠明顯下降，達(dá)到正常水平;131I治療組小鼠甲狀腺對(duì)99mTcO4-的攝取能力低于正常水平。不同方法治療后的小鼠甲狀腺病理學(xué)檢查與未治療的小鼠