中華對(duì)蝦主要致敏原鑒定、提取及有效致敏組分在sIgE檢測(cè)中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　包被抗原作為過(guò)敏原檢測(cè)試驗(yàn)中的關(guān)鍵因素，直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和敏感性。中華對(duì)蝦（Fenneorpenaeus Chinensis，F(xiàn)）是中國(guó)天津地區(qū)甲殼類食物引起的過(guò)敏反應(yīng)中常見的物種，因此，本實(shí)驗(yàn)以中華對(duì)蝦為研究對(duì)象，分析中華對(duì)蝦蛋白提取液中與蝦過(guò)敏患者血清中特異性IgE結(jié)合的蛋白組分，即中華對(duì)蝦的主要致敏蛋白。在此基礎(chǔ)上，將主要的致敏蛋白進(jìn)行初步純化，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提取蛋白作為包被抗原時(shí)的檢測(cè)敏感度?？傊狙?/p>

2、究目的是期望通過(guò)優(yōu)化包被抗原，提高患者血清特異性IgE檢測(cè)結(jié)果的敏感性。
　　方法:
　　1.中華對(duì)蝦蛋白組分及主要過(guò)敏原的鑒定:將提取的中華對(duì)蝦的蛋白溶液通過(guò)SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行蛋白組分分析。以蝦過(guò)敏患者血清中特異性IgE作為“探針”，利用western-blot鑒定中華對(duì)蝦蛋白中的主要致敏蛋白組分。
　　2.中華對(duì)蝦主要致敏蛋白組分的初步純化及鑒定:采用兩種方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離。將分離的中華對(duì)蝦主要致敏蛋白通

3、過(guò)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)和免疫印跡抑制實(shí)驗(yàn)，分析是否達(dá)到了純化目的，并比較分析兩種方法的純化效果，選取較優(yōu)的方法純化大量目的蛋白，進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。
　　3.中華對(duì)蝦主要致敏組分作為包被抗原在血清特異性IgE檢測(cè)中的初步應(yīng)用:利用斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)比較兩種蛋白分別作為包被抗原時(shí)檢測(cè)同一份患者血清中特異性IgE的結(jié)果;并通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的有效組分的檢測(cè)敏感性進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:
　　1.中華對(duì)蝦蛋白組分及主要過(guò)敏

4、原組分的鑒定:中華對(duì)蝦蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蝦蛋白提取液中至少有15種可辨認(rèn)的蛋白顯色條帶，其相對(duì)分子量分別是:130、110、90、87、83、72、70、65、50、39、37、34、29、24和19kDa。其中，大于55kDa的蛋白種類較多，但每種蛋白的濃度相對(duì)較低;小于55kDa的蛋白種類較少，含量較多，其中以50kDa、39kDa和19kDa三處的條帶最為明顯，蛋白含量較高。以20例單例蝦過(guò)敏患者陽(yáng)性血清和

5、1例陰性對(duì)照血清為探針的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:分子量為34、55、72、100、130、140、170以及＞170kDa處為顯色條帶多發(fā)區(qū)，統(tǒng)計(jì)分析主要和20例蝦過(guò)敏患者的血清特異性IgE的蝦蛋白溶液的反應(yīng)條帶后發(fā)現(xiàn)，大于55 kDa的多種蛋白為主要反應(yīng)蛋白，該處的顯色條帶較多，且有些條帶的顏色較深。
　　2.中華對(duì)蝦主要致敏蛋白組分的純化及鑒定:通過(guò)葡聚糖凝膠層析法和超濾離心法純化的蝦主要致敏蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，分子篩層

6、析法收集的peak1-6B蛋白組分主要是55kDa以上的大分子量蛋白組分，有效減少了分離前50、39和19 kDa處的蛋白含量;超速離心分離法將19kDa的蛋白去除，但39和50kDa分子量的蛋白殘留較多，分離效果不如分子篩凝膠層析法。通過(guò)分子篩凝膠層析法大量純化蝦蛋白中的主要過(guò)敏原蛋白，將其作為抑制劑進(jìn)行免疫印跡抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，提取的蝦主要致敏蛋白可以有效的抑制蝦溶液中和過(guò)敏患者血清中特異性IgE反應(yīng)的組分。
　　3.中華對(duì)

7、蝦主要致敏組分作為包被抗原在特異性IgE檢測(cè)中的初步應(yīng)用:通過(guò)斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)比較兩種蛋白溶液作為包被抗原時(shí)的反應(yīng)性。斑點(diǎn)印跡結(jié)果經(jīng)過(guò)Image J軟件分析得到的灰度值顯示:患者血清中特異性IgE含量較低時(shí)，提取的蝦主要致敏組分作為抗原的檢測(cè)體系可以提高檢測(cè)的敏感度。間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:14例蝦過(guò)敏患者中，除2例患者的蝦蛋白溶液作為檢測(cè)抗原的OD值高于peak1-6B組分作為檢測(cè)抗原的OD值外，其余12例患者血清以peak1-6B組

8、分作為包被抗原的OD值均高于蝦蛋白溶液組。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)SDS-PAGE技術(shù)確定了中華對(duì)蝦中的主要的蛋白組分，電泳結(jié)果中清晰可辨的蛋白有15種。
　　2.研究表明本地區(qū)蝦過(guò)敏患者血清特異性IgE能夠識(shí)別的蝦提取蛋白溶液中主要的顯色條帶集中在大于55kDa分子量范圍的多種蛋白處。采用分子篩凝膠層析的分離方法初步獲得了具有免疫活性的peak1-6B組分。
　　3.以純化的peak1-6B組分作為包被抗原，