中華對蝦主要致敏原鑒定、提取及有效致敏組分在sIgE檢測中的初步應用.pdf

1、目的:
　　包被抗原作為過敏原檢測試驗中的關鍵因素，直接影響檢測結(jié)果的準確性和敏感性。中華對蝦（Fenneorpenaeus Chinensis，F(xiàn)）是中國天津地區(qū)甲殼類食物引起的過敏反應中常見的物種，因此，本實驗以中華對蝦為研究對象，分析中華對蝦蛋白提取液中與蝦過敏患者血清中特異性IgE結(jié)合的蛋白組分，即中華對蝦的主要致敏蛋白。在此基礎上，將主要的致敏蛋白進行初步純化，并通過實驗驗證提取蛋白作為包被抗原時的檢測敏感度?？傊?，本研

2、究目的是期望通過優(yōu)化包被抗原，提高患者血清特異性IgE檢測結(jié)果的敏感性。
　　方法:
　　1.中華對蝦蛋白組分及主要過敏原的鑒定:將提取的中華對蝦的蛋白溶液通過SDS-PAGE技術進行蛋白組分分析。以蝦過敏患者血清中特異性IgE作為“探針”，利用western-blot鑒定中華對蝦蛋白中的主要致敏蛋白組分。
　　2.中華對蝦主要致敏蛋白組分的初步純化及鑒定:采用兩種方法對目的蛋白進行分離。將分離的中華對蝦主要致敏蛋白通

3、過SDS-PAGE實驗和免疫印跡抑制實驗，分析是否達到了純化目的，并比較分析兩種方法的純化效果，選取較優(yōu)的方法純化大量目的蛋白，進行接下來的實驗。
　　3.中華對蝦主要致敏組分作為包被抗原在血清特異性IgE檢測中的初步應用:利用斑點印跡實驗比較兩種蛋白分別作為包被抗原時檢測同一份患者血清中特異性IgE的結(jié)果;并通過間接酶聯(lián)免疫吸附實驗對分離的有效組分的檢測敏感性進行評估。
　　結(jié)果:
　　1.中華對蝦蛋白組分及主要過敏

4、原組分的鑒定:中華對蝦蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE實驗結(jié)果顯示，蝦蛋白提取液中至少有15種可辨認的蛋白顯色條帶，其相對分子量分別是:130、110、90、87、83、72、70、65、50、39、37、34、29、24和19kDa。其中，大于55kDa的蛋白種類較多，但每種蛋白的濃度相對較低;小于55kDa的蛋白種類較少，含量較多，其中以50kDa、39kDa和19kDa三處的條帶最為明顯，蛋白含量較高。以20例單例蝦過敏患者陽性血清和

5、1例陰性對照血清為探針的免疫印跡實驗結(jié)果顯示:分子量為34、55、72、100、130、140、170以及＞170kDa處為顯色條帶多發(fā)區(qū)，統(tǒng)計分析主要和20例蝦過敏患者的血清特異性IgE的蝦蛋白溶液的反應條帶后發(fā)現(xiàn)，大于55 kDa的多種蛋白為主要反應蛋白，該處的顯色條帶較多，且有些條帶的顏色較深。
　　2.中華對蝦主要致敏蛋白組分的純化及鑒定:通過葡聚糖凝膠層析法和超濾離心法純化的蝦主要致敏蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，分子篩層

6、析法收集的peak1-6B蛋白組分主要是55kDa以上的大分子量蛋白組分，有效減少了分離前50、39和19 kDa處的蛋白含量;超速離心分離法將19kDa的蛋白去除，但39和50kDa分子量的蛋白殘留較多，分離效果不如分子篩凝膠層析法。通過分子篩凝膠層析法大量純化蝦蛋白中的主要過敏原蛋白，將其作為抑制劑進行免疫印跡抑制實驗的結(jié)果顯示，提取的蝦主要致敏蛋白可以有效的抑制蝦溶液中和過敏患者血清中特異性IgE反應的組分。
　　3.中華對

7、蝦主要致敏組分作為包被抗原在特異性IgE檢測中的初步應用:通過斑點印跡實驗比較兩種蛋白溶液作為包被抗原時的反應性。斑點印跡結(jié)果經(jīng)過Image J軟件分析得到的灰度值顯示:患者血清中特異性IgE含量較低時，提取的蝦主要致敏組分作為抗原的檢測體系可以提高檢測的敏感度。間接ELISA實驗結(jié)果顯示:14例蝦過敏患者中，除2例患者的蝦蛋白溶液作為檢測抗原的OD值高于peak1-6B組分作為檢測抗原的OD值外，其余12例患者血清以peak1-6B組

8、分作為包被抗原的OD值均高于蝦蛋白溶液組。
　　結(jié)論:
　　1.通過SDS-PAGE技術確定了中華對蝦中的主要的蛋白組分，電泳結(jié)果中清晰可辨的蛋白有15種。
　　2.研究表明本地區(qū)蝦過敏患者血清特異性IgE能夠識別的蝦提取蛋白溶液中主要的顯色條帶集中在大于55kDa分子量范圍的多種蛋白處。采用分子篩凝膠層析的分離方法初步獲得了具有免疫活性的peak1-6B組分。
　　3.以純化的peak1-6B組分作為包被抗原，