STAT3在小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)及與NTD的相關(guān)性研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體最重要和最復(fù)雜的系統(tǒng),它謎一樣的發(fā)生過程一直吸引著發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)家的關(guān)注.而其中神經(jīng)管的發(fā)生是關(guān)系到建立中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)原基的重要胚胎學(xué)事件,在這個(gè)過程中,神經(jīng)板必須準(zhǔn)時(shí)準(zhǔn)確地關(guān)閉形成神經(jīng)管,神經(jīng)系統(tǒng)才能得以正常發(fā)育,否則將出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷(neural tube defect,NTD)和隨之而來的脊柱裂或無腦等常見畸形.NTD的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)占出生嬰兒的0.1~0.

2、9﹪,給家庭和社會(huì)帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān).但是迄今對(duì)此復(fù)雜過程的基因表達(dá)與確切調(diào)控途徑均知之甚少,所以正常神經(jīng)管形成的分子機(jī)制和NTD的發(fā)病機(jī)理已成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿.研究發(fā)現(xiàn),胚胎9.5天(E9.5d)時(shí),作為轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription factor-3,STAT3)在早期胚胎發(fā)育中的腦區(qū)有較高水平的表達(dá),而E9.5d正是神

3、經(jīng)管關(guān)閉的重要時(shí)期,這是否提示STAT3有可能參與神經(jīng)管的關(guān)閉呢?它的表達(dá)異常是否和NTD的發(fā)生相關(guān)呢?神經(jīng)管閉合后,神經(jīng)管上皮細(xì)胞的進(jìn)一步增生、分化和遷移,它的前端呈現(xiàn)三個(gè)膨大,依次稱為前腦泡、中腦泡和菱腦泡,前腦泡發(fā)育為端腦和間腦,中腦泡發(fā)育為中腦,菱腦泡的前部發(fā)育為后腦,以后演變?yōu)槟X橋和小腦,菱腦泡的后部發(fā)育延髓,神經(jīng)管尾端形成未來的脊髓.神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增生、分化和遷移對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能的建立十分重要.近年研究發(fā)現(xiàn),有許

4、多基因參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,外環(huán)境也是通過這些基因發(fā)揮作用的.作為轉(zhuǎn)錄因子的STAT3參與很多基因的表達(dá)和調(diào)控,并與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)尤其是神經(jīng)上皮內(nèi)檢測(cè)到STAT3的表達(dá),它是否可能通過啟動(dòng)不同靶基因表達(dá)來參與神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增生、分化和遷移呢?研究提示,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)參與調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育階段的許多關(guān)鍵過程,對(duì)雞胚的研究發(fā)現(xiàn)FGF可能作

5、為直接的神經(jīng)誘導(dǎo)分子,其中FGF-8只在胚胎的早期增殖和神經(jīng)發(fā)生階段表達(dá),涉及神經(jīng)的早期發(fā)育和分化.已知FGFs是激活STAT的重要生長(zhǎng)因子之一,并且FGF2與受體結(jié)合后可以激活STAT3,由于FGF家族成員之間序列有高度的同源性,提示FGF8也可能激活STAT3而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄.FGF8是否可能作為STAT3上游的分子和STAT3共同促使神經(jīng)管關(guān)閉呢?迄今對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尤其是神經(jīng)管關(guān)閉和NTD復(fù)雜過程的基因表達(dá)與調(diào)控的研究剛剛起步,涉及

6、此過程的基因與具體調(diào)控途徑均知之甚少,目前對(duì)正常神經(jīng)管形成和NTD發(fā)生過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機(jī)制的研究也尚無明確定論.該實(shí)驗(yàn)采用全胚胎原位雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫細(xì)胞熒光染色技術(shù)等方法,觀察到了STAT3在胚胎發(fā)育中時(shí)空表達(dá)規(guī)律,尤其在神經(jīng)胚形成階段和神經(jīng)上皮增生、分化和遷移中的表達(dá)變化規(guī)律;并利用喂服過量維甲酸(retinoic acid, RA)誘導(dǎo)NTD模型,觀察發(fā)生NTD的胚胎STAT3的表達(dá)變化;同時(shí)采用全胚胎原位

7、雜交技術(shù)觀察FGF8在正常胚胎神經(jīng)胚形成(neurulation)過程中的表達(dá)和在NTD中的表達(dá)變化,并比較了FGF8和STAT3變化規(guī)律及其關(guān)系,旨在探討STAT3在正常神經(jīng)上皮發(fā)育及神經(jīng)管關(guān)閉過程中的作用,試圖揭示STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用和可能的分子機(jī)制.結(jié)果如下:一、STAT3在小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)1、采用全胚胎原位雜交技術(shù)可觀察到E8.75~11.5d小鼠胚胎STAT3的表達(dá)情況,在E8.75

8、d時(shí)整個(gè)鼠胚幾乎沒有觀察到STAT3 mRNA的表達(dá),在E9.5d,隨著神經(jīng)管的逐漸關(guān)閉,STAT3 mRNA在前腦泡急劇增多,到E10.5d,陽性信號(hào)由前腦泡轉(zhuǎn)移至中腦泡,E11.5d時(shí)僅在后腦泡的一狹窄區(qū)域檢測(cè)到STAT3 mRNA的表達(dá).STAT3胚胎神經(jīng)組織的表達(dá),尤其是神經(jīng)管頭段STAT3的表達(dá)及其時(shí)空變化,提示STAT3有可能參與了這個(gè)時(shí)期神經(jīng)管的關(guān)閉以及神經(jīng)管頭段的發(fā)育.2、該實(shí)驗(yàn)用酶免疫組織化學(xué)方法觀察到在E13.5d,

9、在側(cè)腦室周圍即未來大腦新皮層區(qū)域、間腦、發(fā)育中的視網(wǎng)膜、第四腦室周圍的腦組織(未來的腦橋)、脊髓、三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)C1均可觀察到較強(qiáng)的STAT3陽性信號(hào).E13d正是神經(jīng)上皮套層細(xì)胞開始向邊緣層遷移的時(shí)候,此時(shí)各腦區(qū)大量細(xì)胞表達(dá)STAT3,提示STAT3可能參與了神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和遷移.用熒光免疫組織化學(xué)方法觀察,E14.5d和E15.5d時(shí),大腦皮層、間腦、視網(wǎng)膜、第四腦室周圍以及發(fā)育中的腦橋和脊髓等部位均可觀察到發(fā)中等強(qiáng)度熒

10、光的細(xì)胞,提示在細(xì)胞基本完成遷移和分化后,STAT3的表達(dá)有所下降.二、STAT3與RA致小鼠NTD的關(guān)系1、與正常對(duì)照組相比,喂服RA后孕鼠在E9.5~10.5d可觀察到前腦頂部和后腦未閉合的畸形胚胎,在少數(shù)胚胎可觀察到整個(gè)神經(jīng)管未閉合,呈開放狀態(tài).表明該劑量的RA可以造成CNS發(fā)育的缺陷.2、采用全胚胎原位雜交技術(shù)可以觀察到RA誘導(dǎo)所致NTD畸形的鼠胚STAT3表達(dá)變化的情況,在E9.5、10.5d時(shí) STAT3 mRNA的表達(dá)較正

11、常胚胎減少,在前腦泡和中腦泡未觀察到明顯的STAT3 mRNA表達(dá);E11.5d的胚胎神經(jīng)管已關(guān)閉,與正常鼠胚相比STAT3 mRNA的表達(dá)無明顯變化.研究發(fā)現(xiàn),STAT3分子可以啟動(dòng)一些促進(jìn)細(xì)胞存活的基因轉(zhuǎn)錄,如Bcl-2和Bcl-XL,從而維持細(xì)胞的存活.NTD發(fā)生時(shí)伴有的STAT3表達(dá)下調(diào),這可能是由于RA通過其受體介導(dǎo)引起STAT3 mRNA的表達(dá)下調(diào),影響了Bcl-2和Bcl-XL這類維持細(xì)胞存活的基因轉(zhuǎn)錄并合成相應(yīng)蛋白質(zhì),從

12、而使神經(jīng)管關(guān)閉過程中的細(xì)胞存活受到抑制,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致了NTD發(fā)生.三、FGF8在正常神經(jīng)管形成和NTD中的表達(dá)變化及其與STAT3的關(guān)系研究1、采用全胚胎原位雜交技術(shù)可觀察到E8.75~11.5d小鼠胚胎FGF8的表達(dá)情況,在E8.75d整個(gè)鼠胚幾乎沒有觀察到FGF8 mRNA的表達(dá),在E9.5、10.5d,在前腦泡的前緣、腦峽部位(中腦和后腦之間的一個(gè)狹窄區(qū)域)和神經(jīng)管的尾端可以觀察到較局限的FGF8 mRNA表達(dá),但是E10

13、.5d時(shí),上述三個(gè)部位的表達(dá)較E9.5d減弱;E11.5d腦峽部位基本已無FGF8 mRNA的表達(dá),FGF8 mRNA主要集中在中腦部位.在NTD畸形鼠胚中,E9.5d時(shí)可以觀察到腦峽部位的染色較正常減弱;E10.5d時(shí)NTD鼠胚腦峽部位較正常染色加深,且范圍擴(kuò)大.E9.5d時(shí)FGF8在正常胚胎神經(jīng)管的表達(dá)及NTD時(shí)其表達(dá)減弱說明FGF8可能參與了神經(jīng)管關(guān)閉,其表達(dá)減弱可能是導(dǎo)致NTD發(fā)生的機(jī)制之一;E10.5d時(shí)NTD鼠胚腦峽部位FG

14、F8的表達(dá)增強(qiáng),可能是通過增強(qiáng)FGF8表達(dá)試圖促進(jìn)神經(jīng)管關(guān)閉,就出現(xiàn)了FGF8 mRNA表達(dá)的增強(qiáng).2、STAT3和FGF8的表達(dá)在正常胚胎有重疊,尤其是前腦泡.在NTD模型中二者都發(fā)生了變化,E9.5d時(shí)FGF8和STAT3二者的表達(dá)都減弱,E10.5d時(shí)腦峽部位FGF8表達(dá)增強(qiáng),且范圍擴(kuò)大,而STAT3表達(dá)依然減弱.結(jié)果提示,神經(jīng)管關(guān)閉時(shí)FGF8可能激活STAT3,二者共同作用使神經(jīng)管關(guān)閉;當(dāng)二者表達(dá)下調(diào)時(shí),由于阻斷了的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)