神經(jīng)肽P物質(zhì)對大鼠腹腔肥大細(xì)胞活化的研究.pdf

1、目的：探討神經(jīng)肽P物質(zhì)對大鼠腹腔肥大細(xì)胞活化的作用，以及細(xì)胞外Ca2+對神經(jīng)肽P物質(zhì)活化大鼠腹腔肥大細(xì)胞的影響；探索一種定量檢測肥大細(xì)胞脫顆粒的新方法。方法：1.制備肥大細(xì)胞懸液：取重約200克的SD大鼠，0.05％的EDTA腹腔注射，取腹腔液純化并鑒定肥大細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml。2.神經(jīng)肽P物質(zhì)刺激肥大細(xì)胞釋放組胺的檢測：根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將肥大細(xì)胞分為7組,實驗組Ⅰ～Ⅵ加入神經(jīng)肽P物質(zhì)，終濃度分別為1×10-4、1×1

2、0-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L；以RPMI1640作對照。孵育30分鐘, 以熒光法分別檢測上清和肥大細(xì)胞胞內(nèi)組胺的量，計算組胺釋放率。3.細(xì)胞外Ca2+影響神經(jīng)肽P物質(zhì)活化肥大細(xì)胞釋放組胺的檢測：隨機(jī)將肥大細(xì)胞分7組,實驗組Ⅰ～Ⅴ的Ca2+濃度分別是1、2、3、4、5 mmol/L，各組分別加入神經(jīng)肽P物質(zhì)使終濃度為1×10-4 mol/L；對照組Ⅰ無Ca2+，有神經(jīng)肽P物質(zhì)；對照組Ⅱ僅有RP

3、MI1640。孵育30分鐘，以熒光法檢測組胺，計算組胺釋放率。4. 神經(jīng)肽P物質(zhì)刺激肥大細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和 IL-6的檢測：隨機(jī)將肥大細(xì)胞分為5組,實驗組Ⅰ～Ⅳ加入神經(jīng)肽P物質(zhì)，終濃度分別是1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol/L；以RPMI1640作對照。孵育2天，每天分別取各樣本細(xì)胞上清保存，用ELISA法檢測TNF-α和 IL-6。5.肥大細(xì)胞Annexin V陽性標(biāo)記率的檢測：將所獲肥大細(xì)胞懸液隨機(jī)分

4、為5組,實驗組Ⅰ～Ⅳ加神經(jīng)肽P物質(zhì)，終濃度分別是1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol/L；以RPMI1640作對照。孵育30分鐘,用流式細(xì)胞儀檢測肥大細(xì)胞的Annexin V陽性標(biāo)記率。結(jié)果：1.經(jīng)過不連續(xù)密度梯度離心純化后，所獲肥大細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色顯示存活率達(dá)95％以上。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞呈圓形或卵圓形，大小不一，胞質(zhì)內(nèi)有許多紫紅色顆粒，細(xì)胞核為淡蘭色，表明為肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞純化率可達(dá)93％。2. 神經(jīng)

5、肽P物質(zhì)在1×10-9 ～1×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，肥大細(xì)胞組胺釋放率與神經(jīng)肽P物質(zhì)濃度呈顯著性正相關(guān)（r=0.976,p＜0.01）。各實驗組與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。3.Ca2+濃度在1～3mmol/L的范圍內(nèi)，肥大細(xì)胞的組胺釋放率與Ca2+濃度呈正相關(guān)（r=0.71,p＜0.05）。各實驗組與對照組Ⅰ比較有顯著性差異（p＜0.01）, 對照組Ⅰ較對照組Ⅱ有顯著性差異（p＜0.05) 。最適宜的細(xì)胞外Ca2+

6、濃度為3mmol/L，當(dāng)濃度升高到4mmol/L以上時，組胺釋放率反而下降。4.神經(jīng)肽P物質(zhì)濃度在1×10-7～1×10-4 mol/L范圍內(nèi)，可刺激MC產(chǎn)生TNF-α，第1天產(chǎn)生的量與SP濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.944,p＜0.01），各實驗組與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；第2天產(chǎn)生TNF-α的量與SP濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.994,p＜0.01），各組產(chǎn)生TNF-α的量均較第1天有顯著增加（P＜0.05）。對照組MC

7、產(chǎn)生少量TNF-α，第2天產(chǎn)生的量較第1天減少（P＜0.05）。5.神經(jīng)肽P物質(zhì)濃度在1×10-7～1×10-4 mol/L范圍內(nèi)，可刺激MC產(chǎn)生IL-6，第1天產(chǎn)生的量與SP濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.816,p＜0.05），各實驗組較對照組有顯著性差異（P＜0.05）；第2天產(chǎn)生IL-6的量與SP濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.947,p＜0.01），各組產(chǎn)生IL-6的量均較第1天有顯著增加（P＜0.05）；對照組MC產(chǎn)生少量IL-6，第2

8、天產(chǎn)生的量較第1天減少（P＜0.05）。6.神經(jīng)肽P物質(zhì)刺激肥大細(xì)胞的Annexin V陽性標(biāo)記率檢測：神經(jīng)肽P物質(zhì)濃度在1×10-7 ～1×10-4 mol/L范圍內(nèi)，肥大細(xì)胞的Annexin V 陽性標(biāo)記率與神經(jīng)肽P物質(zhì)濃度呈顯著性正相關(guān)（r=0.830,p＜0.01），各實驗組與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）;Annexin V 陽性標(biāo)記率與組胺釋放率呈顯著性正相關(guān)(r=0.99,p<0.01)。結(jié)論：神經(jīng)肽P物質(zhì)能活化大