氫氣飽和滅菌水對(duì)Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化的影響.pdf

1、目的：
　?、裥妥儜B(tài)反應(yīng)疾病是一類由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病，主要包括支氣管哮喘，鼻炎，結(jié)膜炎等疾病。主要表現(xiàn)為大量表達(dá)Th2細(xì)胞因子、嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)引發(fā)炎性反應(yīng)。近年來(lái)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率明顯升高,其受重視程度日益增強(qiáng)。Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病是一種需要從多角度多層面綜合性治療的疾病，而現(xiàn)階段對(duì)其尚沒(méi)有完善治療方法，它已成為一個(gè)全球性健康問(wèn)題。近期大量研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中貫穿始終，起核

2、心作用。肥大細(xì)胞是速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞，其激活直接影響次級(jí)效應(yīng)細(xì)胞—嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集和激活，是重要的調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，是介導(dǎo)速發(fā)型過(guò)敏和炎癥的重要樞紐，能引發(fā)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。同時(shí)，肥大細(xì)胞還參與了許多疾病和炎癥過(guò)程，特別是與一些變態(tài)反應(yīng)性疾病如蕁麻疹、銀屑病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生關(guān)系密切。但是對(duì)于肥大細(xì)胞活化的確切機(jī)制尚不清楚，調(diào)控肥大細(xì)胞活化的藥物也寥寥無(wú)幾，如果能夠深入探明肥大細(xì)胞在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中作用機(jī)以及干預(yù)靶

3、點(diǎn)，尋找有效干預(yù)其活化的臨床治療方案，將有利于進(jìn)一步完善過(guò)敏性哮喘等相關(guān)疾病的防治策略。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)氫分子作為一種新興的氣體信號(hào)分子，具有干預(yù)多種炎癥反應(yīng)（如急性胰腺炎、急性肺炎等）以及免疫調(diào)節(jié)作用，因此本研究以小鼠肥大細(xì)胞P815為研究對(duì)象，建立肥大細(xì)胞活化模型，從干預(yù)肥大細(xì)胞活化的角度探索氫氣飽和滅菌水治療Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病的潛在機(jī)制及靶點(diǎn)，為治療Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病提供新的思路。
　　方法：
　　肥大細(xì)胞(P815小鼠肥大細(xì)

4、胞株，購(gòu)買來(lái)自美國(guó))在1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中含有10％新生小牛血清，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組：正?？瞻讓?duì)照組(Con組)、Anti-DNP-IgE模型組(Anti-DNP-IgE組)、氫氣飽和滅菌水治療組(Anti-DNP-IgE+H2組)、單純氫氣飽和滅菌水組(H2組)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)確定了Anti-DNP-IgE的最適宜濃度及干預(yù)時(shí)間。通過(guò)對(duì)各組進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色從形態(tài)學(xué)角度揭示氫氣飽和滅菌水對(duì)于Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化是

5、否影響,初步觀察氫氣飽和滅菌水對(duì)Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化的影響；通過(guò) ELISA試劑盒檢測(cè)肥大細(xì)胞活化的關(guān)鍵性的指標(biāo)包括組胺(HIS)，β氨基己糖苷酶(β-Hex)以及類胰蛋白酶(TPS)在各組中水平從免疫調(diào)節(jié)角度驗(yàn)證氫氣飽和滅菌水對(duì)于Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化究竟有何種影響;從形態(tài)學(xué)角度應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)一步研究氫氣飽和滅菌水干預(yù)肥大細(xì)胞活化機(jī)制的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)與受體

6、(FceRIβ)結(jié)合情況。進(jìn)一步從分子角度探討氫氣飽和滅菌水調(diào)控肥大細(xì)胞活化的分子機(jī)制，Western Blot方法觀察氫氣飽和滅菌水是否干預(yù)肥大細(xì)胞活化機(jī)制的初始階段三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)以及下游通路PI3K-AKT分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 Anti-DNP-IgE激活肥大細(xì)胞的最適干預(yù)時(shí)間和濃度。
　　通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)確定Anti-DNP-IgE激活肥大細(xì)胞的最適宜濃度及

7、干預(yù)時(shí)間分別為1000ng／ml、10h。
　　2肥大細(xì)胞活化的甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察。
　　正常對(duì)照與單純氫氣飽和滅菌水組無(wú)明顯改變，Anti-DNP-IgE模型組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分泌囊泡明顯增多，而氫氣飽和滅菌水治療組內(nèi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡明顯減少。從形態(tài)學(xué)角度初步證明了氫氣飽和滅菌水對(duì)肥大細(xì)胞活化是有影響的。
　　3氫氣飽和滅菌水抑制了Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化。
　　本課題選用肥大細(xì)胞活化三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)（組

8、胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶），提取各組細(xì)胞上清液，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞組胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶的ELISA水平檢測(cè)：Anti-DNP-IgE模型組中的組胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶水平相比正常對(duì)照組明顯升高，而氫氣飽和滅菌水治療相比Anti-DNP-IgE模型組有明顯降低。說(shuō)明氫氣飽和滅菌水對(duì)于肥大細(xì)胞活化指標(biāo)具有明顯的抑制作用。
　　4形態(tài)學(xué)角度觀察氫氣飽和滅菌水對(duì)肥大細(xì)胞活化的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激

9、酶影響。
　　免疫熒光雙重定位染色結(jié)果顯示：Anti-DNP-IgE刺激后，發(fā)現(xiàn)Syk、Lyn以及Fyn三種蛋白會(huì)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的重新分布，均會(huì)向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移；而經(jīng)氫氣干預(yù)后，會(huì)抑制上述轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)說(shuō)明氫氣飽和滅菌水可能通過(guò)抑制三種酪氨酸激酶通路來(lái)抑制肥大細(xì)胞活化。
　　5氫氣飽和滅菌水抑制了肥大細(xì)胞活化初始階段的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶的激活。
　　Western blot結(jié)果顯示Anti-DNP-IgE刺激后，

10、P-SYK、P-LYN、P-FYN表達(dá)明顯增高；而經(jīng)氫氣飽和滅菌水干預(yù)后上述指標(biāo)表達(dá)明顯減少。說(shuō)明氫氣飽和滅菌水可能抑制三種酪氨酸蛋白激酶的表達(dá)，從而達(dá)到對(duì)肥大細(xì)胞活化抑制的作用。
　　6氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。
　　Western blot結(jié)果顯示，相比于Anti-DNP-IgE模型組，氫氣飽和滅菌水治療組的P-PI3K以及P-AKT表達(dá)明顯減少。說(shuō)明氫氣飽和滅菌水抑

11、制Anti-DNP-IgE刺激后肥大細(xì)胞活化，可能是通過(guò)抑制肥大細(xì)胞活化下游經(jīng)典通路PI3K-AKT的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　1氫氣飽和滅菌水對(duì)Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化具有抑制作用。
　　2氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化初始階段的三種關(guān)鍵酪氨酸激蛋白酶（Lyn、Syk、Fyn）的膜轉(zhuǎn)移以及磷酸化的過(guò)程。
　　3氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活<