化毒補(bǔ)虛方對人肺腺癌A549細(xì)胞Smac、CDK4基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的:研究臨床驗方化毒補(bǔ)虛方含藥血清體外對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，并通過RT-PCR法檢測其對Smac、CDK4基因表達(dá)的影響，探討化毒補(bǔ)虛方治療肺癌的作用機(jī)制。
　　方法:(1)以化毒補(bǔ)虛方水煎液為SD大鼠灌胃，設(shè)為實驗組;空白組予以生理鹽水灌胃;待大鼠血清含藥濃度達(dá)到理論穩(wěn)態(tài)時（灌胃5天以上）采血，分離大鼠血清，分別制備為含藥血清和空白血清;(2)MTT法:在96孔板內(nèi)接種肺癌A549細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞總

2、數(shù)約為5×103個，100ul/孔，設(shè)空白血清組、12.5％含藥血清組、25％含藥血清組、50％含藥血清組、順鉑藥物組，分別觀察24h、48h細(xì)胞增殖情況，采用MTT比色分析法檢測不同濃度、不同時間化毒補(bǔ)虛方大鼠含藥血清對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響;(3)Annexinv/PI雙染色流式法:在75cm2培養(yǎng)瓶中接種肺癌A549細(xì)胞懸液，每瓶細(xì)胞總數(shù)約為1×104個，5ml/瓶，設(shè)空白血清組、12.5％含藥血清組、25％含藥血清組、50％

3、含藥血清組、順鉑藥物組，分別觀察24h、48h細(xì)胞凋亡情況，采用Annexinv/PI雙染色流式法檢測化毒補(bǔ)虛方大鼠含藥血清對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響;(4)RT-PCR法:在75cm2培養(yǎng)瓶中接種肺癌A549細(xì)胞懸液，每瓶細(xì)胞總數(shù)約為1×104/ml，5ml/瓶，設(shè)空白血清組、12.5％含藥血清組、25％含藥血清組、50％含藥血清組，用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測48小時化毒補(bǔ)虛方大鼠含藥血清對肺癌A549細(xì)胞Sma

4、c、CDK4基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:加入化毒補(bǔ)虛方含藥血清后，鏡下可見細(xì)胞增殖緩慢，密度明顯減低;貼壁細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，部分細(xì)胞逐漸皺縮，胞體折光性減弱;隨著含藥血清濃度增大，處理時間延長，部分細(xì)胞逐漸變圓脫落。結(jié)果表明，與同時間點空白血清組相比，化毒補(bǔ)虛方含藥血清對人肺腺癌A549細(xì)胞具有一定的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，可使A549細(xì)胞增殖速度減慢，抑制正常細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)凋亡，且隨著作用時間的延長和含藥

5、血清濃度的增加，其增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡作用明顯增加。
　　(2)MTT結(jié)果:25％、50％的化毒補(bǔ)虛方含藥血清組與同時間點空白血清組相比，均對細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，其24h抑制率(％)分別為(5.850±2.326)、(16.133±10.366)(P＜0.05)，48h抑制率(％)分別為(6.700±3.483)、(21.650±9.515)P＜0.05)，50％含藥血清較25％含藥血清抑制作用更為顯著(P＜0.05)，且隨處

6、理時間延長而其抑制作用也隨之增加。
　　(3)Annexinv/PI雙染色流式結(jié)果:12.5％含藥血清、25％含藥血清、50％含藥血清組24h誘導(dǎo)凋亡率(％)分別為(2.53±0.75)、(4.90±1.51)、(11.78±1.05)（P＜0.01)，48h誘導(dǎo)凋亡率(％)分別為(3.35±0.50)、(8.60±0.85)、(15.90±0.99)（P＜0.01)，表明化毒補(bǔ)虛方各濃度含藥血清組與同時間點空白血清組相比，差異有

7、顯著地統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)，說明化毒補(bǔ)虛方對A549細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。其誘導(dǎo)凋亡作用在一定時間內(nèi)與劑量-時間呈正相關(guān)關(guān)系，即隨著作用時間的延長和含藥血清濃度的增加，其誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)?；狙a(bǔ)虛方50％含藥血清組作用48h，達(dá)到其最大誘導(dǎo)凋亡率，為15.90％左右。
　　(4)RT-PCR結(jié)果:從實驗結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖可看出，化毒補(bǔ)虛方含藥血清作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時后，與對空白血清組比較，Smac

8、mRNA表達(dá)顯著增加，CDK4 mRNA表達(dá)顯著下降，且隨含藥血清濃度升高其趨勢更為顯著。Smac mRNA蛋白相對含量為:空白血清組(0.73±0.055)，化毒補(bǔ)虛方12.5％含藥血清組(0.79±0.140)，25％含藥血清組(1.02±0.029)，50％含藥血清組(1.14±0.053)。25％、50％含藥血清組與空白組相比均有顯著差異（P＜0.01)。CDK4 mRNA蛋白相對含量為:空白血清組(1.61±0.029)，化毒

9、補(bǔ)虛方12.5％含藥血清組(1.12±0.058)，25％含藥血清組(0.71±0.013)，50％含藥血清組(0.37±0.035)。含藥血清組與空白組相比均有顯著差異（P＜0.01）。由圖像與數(shù)據(jù)可得出共同結(jié)果，化毒補(bǔ)虛方含藥血清能有效上調(diào)A549細(xì)胞Smac基因的表達(dá)，下調(diào)CDK4基因的表達(dá)。
　　結(jié)論:化毒補(bǔ)虛方對體外人肺癌A549細(xì)胞有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，其作用隨著藥物濃度升高、處理時間延長而作用更為顯著，且