CCK-8對LPS誘導大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞MnSOD基因表達的影響.pdf

1、目的： 膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽。CCK在體內(nèi)存在多種活性片段如4肽、8肽、33肽、39肽和58肽等，其中八肽膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide，CCK-8)是其最主要的活性形式。CCK通過其受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，CCK受體屬于G蛋白藕聯(lián)受體，根據(jù)其親和力以及生物學功能不同，CCK受體分為A、B兩種亞型。近年來研究顯示，CCK-8及其受體在哺乳類動物體

2、內(nèi)分布十分廣泛。已有文獻報道，CCK-8可緩解失血性休克，在內(nèi)毒素血癥患者的血液中CCK-8含量顯著升高。此后本室的系列研究證實，內(nèi)、外源腦腸肽CCK-8確實具有抗內(nèi)毒素休克(endotoxin shock，ES)作用，可減輕ES發(fā)生早期的肺循環(huán)和體循環(huán)血流動力學紊亂，其機制與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有關(guān)。 在ES發(fā)病過程中，一方面脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所導致的氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的超氧陰離子(O<'-><

3、,2>·)；另一方面誘導包括血管平滑肌細胞(VSMC)在內(nèi)的機體多種細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達，產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)，NO和O<'-><,2>·形成過氧亞硝基陰離子(ONOO<'->)。NO、O<'-><,2>·以及ONOO參與啟動機體氧化應(yīng)激、介導ES發(fā)病過程中肺循環(huán)和體循環(huán)血管反應(yīng)性異常改變，因此，O<'-><,2>·的產(chǎn)生和清除機制研究是十分重要的。 超氧化物歧化酶(superoxide dismuta

4、se，SOD)是機體清除O<'-><,2>·唯一的特異性酶，可使體內(nèi)的O<'-><,2>·維持在一定水平。目前，在真核細胞中發(fā)現(xiàn)有3種SOD：分布于細胞漿的CuZnSOD，分布于線粒體的MnSOD和分泌到細胞外的EC SOD，其qhMnSOD是一種誘生型酶，多種因素如氧化應(yīng)激、腫瘤壞死因子和LPS等，都可誘導MnSOD表達增加。 我們已往的研究結(jié)果顯示，VSMC存在CCK-8受體，CCK-8對LPS誘導的培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞SO

5、D活性變化具有一定的調(diào)節(jié)效應(yīng)，CCK-8作用的靶點可能是血管SOD和O<'-><,2>·的生成系統(tǒng)。然而，CCK-8調(diào)節(jié)血管SOD活性變化的機制尚不清楚。由于MnSOD是誘生型酶且分布在與氧化應(yīng)激發(fā)生密切相關(guān)的線粒體，探索CCK-8對LPS誘導MnSOD基因表達的影響及其信號轉(zhuǎn)導機制如受體機制是必要的。本實驗擬探討CCK-8對LPS誘導血管平滑肌細胞MnSOD基因表達的影響，以闡明CCK-8抗ES作用的分子機制。 方法：

6、 選用雄性、健康Wistar大鼠(120±20g)，無菌條件下分離大鼠胸主動脈，用貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細胞(TASMCs)，傳代至對數(shù)生長期(實驗用5-8代)，調(diào)整細胞密度為每瓶1×10<'7>，加入無血清DMEM培養(yǎng)液以及不同處理因素，檢測MnSOD mRNA的表達情況。 實驗程序： 1、分別用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L LPS以及生理鹽水孵育TASMCs 4h，用0.1mg/L L

7、PS孵育TASMCs2h、4h、8h，檢測MnSOD mRNA表達變化，以觀察LPS誘導TASMCs MnSOD mRNA表達的時效與量效關(guān)系。 2、用0.1mg/L LPS分別和10<'-6>、10<'-8>、10<'-10>mol/L CCK-8共同處理細胞4h，檢測MnSOD mRNA表達變化，以觀察CCK-8對LPS誘導TASMCs MnSOD mRNA表達的影響。 3、在前述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇CCK

8、-8、LPS各一個劑量和一個時間點，CCK-8+LPS與丙谷胺(Pro，CCK受體非特異性阻斷劑)、CR-1409(CCK-A受體特異性阻斷劑)或CR-2945(CCK-B受體特異性阻斷劑)處理細胞，另設(shè)Pro、CR-1409、CR-2945對照組，檢測MnSOD mRNA表達變化，研究CCK-8對LPS誘導TASMCs MnSOD mRNA表達影響的受體機制。用RT-PCR方法檢測MnSOD基因表達，用江蘇捷達凝膠分析軟件對電泳譜帶進

9、行半定量分析，用MnSOD與β-actin的吸光度比值代表MnSOD mRNA相對表達水平。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較行單因素方差分析(one-wayANOVA)，有顯著差異者進一步用最小顯著差法(LSD)進行兩兩比較，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、在TASMCs存在MnSOD mRNA基礎(chǔ)表達；與對照組相比，0.01mg/L、0.1mg/

10、L及1.0mg/L LPS分別孵育細胞4h可劑量依賴性引起MnSOD mRNA表達升高(P<0.05)；在LPS誘導TASMCs MnSOD表達的時效關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)2h就可誘導MnSOD mRNA表達升高(P<0.05)，4h表達達到高峰(P<0.05)，8h持續(xù)高表達(P<0.05)。 2、10<'-6>、10<'-8>、10<'-10>mol/L CCK-8預(yù)先處理TASMCs 30min后加入LPS，MnSOD mRNA

11、表達可不同程度地被抑制，與LPS組相比有顯著性差異(P<0.05)；CCK-8的抑制效應(yīng)具有濃度依賴性(P<0.05)；CCK-8(10<'-8>mol/L)單獨處理細胞可導致TASMCs MnSOD mRNA表達明顯下調(diào)，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。 3、預(yù)先用CR-1409、CR-2945、Pro孵育細胞10min后再給予CCK-8和LPS，CR-1409+CCK-8+LPS和CR-2945+CCK-8+L

12、PS組MnSOD mRNA表達與CCK-8+LPS組相比明顯升高(P<0.05)，但仍低于LPS組(P<0.05)，其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409更為顯著(P<0.05)；Pro+CCK-8+LPS組則完全翻轉(zhuǎn)了CCK-8的抑制效應(yīng)。 結(jié)論： CCK-8對TASMCs MnSOD mRNA的基礎(chǔ)表達具有抑制性調(diào)節(jié)作用；LPS可劑量依賴性誘導TASMCs MnSODmRNA表達上調(diào)，MnSOD mRNA