血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義及siRNA-TLR4對血管平滑肌細(xì)胞功能的影響.pdf

1、第一部分：血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá) 目的：研究血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)及在脂多糖(LPS)作用下的表達(dá)變化特點。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，傳到7～9代。不同濃度LPS作用于HASMCs 24小時；10ng/ml LPS作用于HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h和48h。應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物；實時熒光定量PCR法對LPS不同作用條件下TLR4 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2、免疫熒光檢測血管平滑肌細(xì)胞TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法測定LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達(dá)量的變化；流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達(dá)量的變化。 結(jié)果： 1．正常情況下，人主動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)少量TLR4 mRNA。LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)； TLR4 mRNA在LPS作用下發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 2．正常情況下，人主動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)少量TLR4

3、蛋白。LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)；受體TLR4蛋白在LPS作用下發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 結(jié)論：人動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)TLR4；LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4的表達(dá)發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 第二部分：血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義 目的：研究血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，傳到7～9代。10n

4、g/ml LPS作用于HASMCs 24h。應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR產(chǎn)物。Western blot法測定10ng/ml LPS作用24小時后，MMP-2，9蛋白表達(dá)量的變化。明膠酶譜法測定MMP-2，9活性。EMSA法測定動脈平滑肌細(xì)胞核因子-кB(NF-кB)的結(jié)合活性。抗受體TLR4抗體抑制LPS激活受體TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽抑制NF-кB的結(jié)合活性。 結(jié)果： 1．L

5、PS通過其受體TLR4調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA的表達(dá)，而對MMP-2 mRNA表達(dá)無影響。 2．LPS上調(diào)的MMP-9 mRNA能夠翻譯表達(dá)更多量的MMP-9蛋白；而對MMP-2蛋白的表達(dá)無影響。 3．LPS通過其受體TLR4使血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-9表達(dá)增加的同時，使MMP-9酶解活性相應(yīng)增加；而LPS對MMP-2的酶解活性也沒有產(chǎn)生影響。 4．LPS能夠通過其受體TLR4影響血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-кB的結(jié)合

6、活性。 5．受體TLR4依賴NF-кB激活途徑調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)及活性。 結(jié)論：LPS通過TLR4-NF-кB途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及其活性；而激活受體TLR4對MNIP-2 mRNA和蛋白表達(dá)及其活性無影響。 第三部分： siRNA-TLR4對血管平滑肌細(xì)胞功能的影響 目的：研究siRNA-TLR4對血管平滑肌細(xì)胞功能的影響。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HAS

7、MCs)，傳到7～9代。應(yīng)用Lipofectamine<'TM>2000轉(zhuǎn)染siRNA-TLR4。MTT法測定細(xì)胞生存率。實時熒光定量PCR法對轉(zhuǎn)染siRNA后TLR4 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。Western blot法檢測轉(zhuǎn)染siRNA后TLR4蛋白表達(dá)變化。Lipofectamine<'TM>2000轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于HASMCs 24h，應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMPs

8、)RT-PCR產(chǎn)物；Western blot法測定10ng/ml LPS作用24小時后，MMP-2，9蛋白表達(dá)量的變化；明膠酶譜法測定MMP-2，9活性。 結(jié)果： 1．轉(zhuǎn)染的siRNA序列本身不會對細(xì)胞生存率產(chǎn)生影響，同時也說明siRNA序列本身是安全的。 2．3個不同序列siRNA對血管平滑肌細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的抑制效率不同，以TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRN

9、A-1明顯抑制LPS對MMP-9 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，而對MMP-2的表達(dá)無影響。單獨轉(zhuǎn)染siRNA-1對MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)都沒有影響。 4．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對MMP-9蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，而對MMP-2的表達(dá)無影響。單獨轉(zhuǎn)染siRNA-1對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)都沒有影響。 5．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對MMP-9酶活性的上調(diào)作用，而對MMP-