KISS1過表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)作用的研究.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類的生命及健康，其發(fā)病機(jī)制迄今尚不完全明確。肺癌的早期臨床癥狀輕微，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬中晚期，因而造成了大量的術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)尋找與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子仍然是人類面臨的亟需解決的重大問題。KISS1是Lee等在1997年利用修飾遞減雜交技術(shù)在黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，編碼一個(gè)由145個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白，其氨基酸位點(diǎn)上存在著具有Src癌蛋白SH-3區(qū)特征的P

2、XXP，可抑制帶有SH-3的各種因子，參與轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制多種腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。
　　NF-κB是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于人的各種細(xì)胞中，調(diào)節(jié)從免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)到炎癥等多個(gè)基因的表達(dá)，它的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)多種疾病的發(fā)生。NF-κB最常見的形式是由p50和p65組成的異源二聚體，NF-κB在細(xì)胞中與其阻抑物IκBα蛋白結(jié)合，以非活性形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)它被激活后，通過信號(hào)傳導(dǎo)引起IκB的泛素化及

3、蛋白酶體途徑的降解，導(dǎo)致NF-κB-IκB復(fù)合物解體，解離的NF-κB進(jìn)入到核內(nèi)并暴露它的核識(shí)別位點(diǎn)，與特定靶基因結(jié)合而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄開放，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，在很多癌癥中可以觀察到NF-κB的異常，它通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活一些與細(xì)胞增殖、血管新生、轉(zhuǎn)移、腫瘤惡化、抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)基因的表達(dá)來參與腫瘤的發(fā)生和惡化過程。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)是一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜能力的

4、蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起重要作用，在腫瘤演進(jìn)等眾多生理和病理過程中均發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)有較高M(jìn)MP9的表達(dá)，且其表達(dá)程度與腫瘤的侵襲性有關(guān)。
　　目前研究表明KISS1、NF-κBp65和MMP9在多種腫瘤組織中均存在異常表達(dá)，并證實(shí)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程存在密切關(guān)系，但目前對(duì)三者的研究多數(shù)是在各自獨(dú)立的層面上，且三者之間的關(guān)系及相互作用機(jī)制至今尚未完全闡明，在肺癌中三

5、者結(jié)合起來研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。多種腫瘤細(xì)胞KISS1處于低表達(dá)狀態(tài)，通過基因修飾可以增加KISS1蛋白的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中KISS1過表達(dá)若能激活NF-κB信號(hào)通路，封鎖NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，減少其與MMP-9啟動(dòng)子的結(jié)合，進(jìn)而使MMP9轉(zhuǎn)錄水平下降，MMP-9蛋白合成減少，籍以降低對(duì)Ⅳ型膠原及層粘連蛋白等成份的降解，減少對(duì)基底膜完整性的破壞，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，這也成為本課題立題的切入點(diǎn)所在。
　　本研究中，我們首先利用免疫組

6、化技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)及免疫印跡技術(shù)測(cè)定人肺癌及癌旁組織中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA及蛋白的表達(dá)情況及相互關(guān)系，旨在探討三者在肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。隨后利用基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人KISS1基因cDNA序列，構(gòu)建pEGFP-KISS1表達(dá)載體，并構(gòu)建用于FRET實(shí)驗(yàn)的pECFP-KISS1及pEYFP-p65載體;將成功構(gòu)建的pECFP-KISS1及pEYFP-p65載體轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，利用激

7、光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行基于感應(yīng)發(fā)射法的FRET實(shí)驗(yàn)及全波段掃描FRET技術(shù)測(cè)定KISS1與NF-κBp65蛋白之間的相互作用;采用MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)pEGFP-N1-KISS1載體轉(zhuǎn)染后對(duì)KISS1、NF-κBp65和MMP9轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的調(diào)節(jié)及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力的影響。
　　本研究分為以下四個(gè)部分:
　　第一部分KISS1

8、在肺癌組織中的表達(dá)及意義
　　方法:
　　1.免疫組化檢測(cè)35例肺癌及癌旁組織中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表達(dá)。
　　2.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)35例肺癌及癌旁組織中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA的表達(dá)。
　　3.免疫印跡技術(shù)檢測(cè)35例肺癌及癌旁組織中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表達(dá)。
　　4.肺癌組織中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的相互關(guān)系。<

9、br>　　結(jié)果:
　　1.免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄PCR及免疫印跡結(jié)果顯示KISS1在癌旁組織表達(dá)高于肺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);NF-κBp65、MMP9在肺癌組織中高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　2.KISS1和NF-κBp65、MMP9在肺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分KISS過表達(dá)載體及FRET實(shí)驗(yàn)相關(guān)載體的構(gòu)建
　　方法:
　　1.應(yīng)用基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人KIS

10、S1基因cDNA序列，經(jīng)酶切、回收并連接到真核載體pEGFP-N1，構(gòu)建pEGFP-KISS1載體，
　　2.應(yīng)用基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人KISS1及NF-κBp65基因cDNA序列，經(jīng)酶切、回收并連接到真核載體pECFP-N1及pEYFP-C1，構(gòu)建pECFP-KISS1及pEYFP-p65載體，
　　3.利用酶切法及測(cè)序法對(duì)pEGFP-N1-KISS1、pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65載體進(jìn)行鑒定。

11、>　　結(jié)果:
　　1.成功克隆了人KISS1基因的全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)測(cè)序后與GeneBank序列比對(duì)完全一致;
　　2.成功構(gòu)建了pEGFP-N1-KISS1表達(dá)載體，酶切、測(cè)序鑒定正確;
　　3.成功構(gòu)建了pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65載體，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確。
　　第三部分FRET技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)KISS1蛋白與NF-kBp65蛋白的相互作用
　　方法:
　　1.將成

12、功構(gòu)建的pECFP-KISS1及pEYFP-p65載體轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，利用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　2.利用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行基于感應(yīng)發(fā)射法的FRET實(shí)驗(yàn)。
　　3.采用全波段掃描FRET技術(shù)測(cè)定計(jì)算525nm/465nm熒光強(qiáng)度比值，測(cè)定KISS1與NF-κBp65蛋白之間的相互作用
　　結(jié)果:
　　1.pECFP-N1-KISS1及pEYFP-C1-p65轉(zhuǎn)染效率分別為73.26％和81.43

13、％;
　　2.共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示A549細(xì)胞中KISS1與NF-κBp65蛋白有明顯的FRET現(xiàn)象;
　　3.在共表達(dá)pECFP-N1-KISS1與pYFP-C1-p65的肺癌細(xì)胞中，525nm/465nm熒光強(qiáng)度的比值為(3.15±0.43)，與對(duì)照組pEYFP-C1-p65+pECFP(0.59±0.13)和pECFP-N1-KISS1+pEYFP(0.67±0.18)相比，有明顯差異（P＜0.05），說明KISS

14、1及NF-κBp65蛋白存在相互作用。
　　第四部分KISS1基因過表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　方法:
　　1.將KISS1過表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率;
　　2.MTT法檢測(cè)對(duì)照組、空載體組及KISS1組A549細(xì)胞增殖能力的變化。
　　3.克隆平板形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、空載體組及KISS1組A549細(xì)胞克隆形成能力的變化。
　　4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、空

15、載體組及KISS1組細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　5.逆轉(zhuǎn)錄-PCR法檢測(cè)對(duì)照組、空載體組及KISS1組KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA含量。
　　6.免疫印跡法檢測(cè)對(duì)照組、空載體組及KISS1組KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的含量。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示ALDH1A2過表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示ALDH1A2過表達(dá)降低了A549細(xì)胞克隆

16、形成能力。
　　3.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALDH1A2過表達(dá)能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲能力。
　　4.RT-PCR及Wb檢測(cè)結(jié)果顯示:KISS1mRNA及蛋白含量在KISS1組顯著高于對(duì)照組及空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);NF-κBp65和MMP9mRNA及蛋白含量在KISS1組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.人肺癌組織中KISS1表達(dá)低于癌旁組

17、織，NF-κBp65和MMP9表達(dá)高于癌旁組織，KISS1和NF-κBp65、MMP9在肺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建了pECFP-KISS1及pEYFP-p65載體，經(jīng)酶切，測(cè)序鑒定正確。
　　3.成功構(gòu)建并鑒定了KISS1基因過表達(dá)真核表達(dá)載體，并獲得穩(wěn)定過表達(dá)KISS1的A549細(xì)胞。
　　4.共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示A549細(xì)胞中KISS1與NF-κBp65蛋白有明顯的FRET現(xiàn)象;
　　5