姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體制備及其對肺癌細胞A549生物學(xué)特性的影響.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其中80﹪以上是非小細胞肺癌(NSCLC),對放療、化療的敏感性差.腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素. 姜黃色素是中國傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成分,包含姜黃素I(姜黃素)、姜黃素II(脫甲氧基姜黃素)和姜黃素Ⅲ(雙脫甲氧基姜黃素)3種單體.近年研究表明,姜黃色素可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段(始發(fā)、促進和演進),并可通過抑制血管生成抗腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,其中以姜黃素Ⅲ的抗癌活性最強.作為一種有良好發(fā)

2、展前景的抗癌藥物,目前姜黃色素在腫瘤預(yù)防和治療方面的作用已經(jīng)引起人們的重視,成為研究熱點.但是,姜黃色素難溶于水,在體外也容易被氧化,難以進行靜脈給藥,目前也沒有穩(wěn)定性較好的藥物劑型,口服的姜黃素大部分也在胃腸道內(nèi)被代謝而失活,被吸收到血循環(huán)中的量很少.由于上述原因,為姜黃素的臨床應(yīng)用,特別是在肺癌等非胃腸道腫瘤治療中的使用帶來了一定的難度.脂質(zhì)體包裹技術(shù)可解決脂溶性藥物不易溶于水的難題,提高易氧化藥物在體內(nèi)外的穩(wěn)定性,降低被包封藥物的

3、毒性,增加藥物被增殖旺盛的癌細胞的攝取量,因此是抗腫瘤藥物的理想載體.鑒于此,該課題應(yīng)用脂質(zhì)體來包裹抗癌活性最強的姜黃素Ⅲ單體,并以肺腺癌A549細胞作為研究對象,旨在探討以脂質(zhì)體作為載體制成能適合于靜脈使用的姜黃素新劑型的可能性,并進一步了解其對肺腺癌細胞生物學(xué)特性的影響,為姜黃素在肺癌治療當(dāng)中應(yīng)用的深入研究提供一定實驗基礎(chǔ).方法:(一)姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體制備及大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗.1.姜黃素Ⅲ單體提取與脂質(zhì)體制備.采用乙醇提取,硅膠柱

4、層析、丙酮純化的方法提取和分離姜黃色素單體,獲得所需要的姜黃素Ⅲ,以乙醇注入法制備姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體,檢測脂質(zhì)體的包封率、粒徑大小和初步穩(wěn)定性.2.姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)初步研究.比較姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體和游離姜黃素Ⅲ注射液在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué),了解改變劑型后姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體在血藥代動力學(xué)參數(shù)上的變化,探討以脂質(zhì)體為載體后,姜黃素Ⅲ靜脈應(yīng)用的可能性.(二)姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體對人肺腺癌細胞A549生物學(xué)特性的影響.1.姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體對A54

5、9細胞的增殖影響.通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT試驗、流式細胞儀檢測等研究加入姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體作用后,體外培養(yǎng)的A549細胞增殖活性和細胞周期的改變.2.姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體誘導(dǎo)A549細胞凋亡的實驗研究.丫啶橙染色,原位缺口末端標(biāo)記檢測,透射電鏡進一步觀察姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體對A549細胞凋亡和壞死的影響,RT-PCR在mRNA水平檢測bcl-2基因的表達.主要實驗結(jié)果:1. 經(jīng)乙醇提取→石油醚脫脂→硅膠柱層析→丙酮純化的途徑提取和分離姜黃素活性單體效果良

6、好,操作簡便,并具有可重復(fù)性.2. 經(jīng)優(yōu)化后的乙醇注入法為制備的最佳方法,獲得的姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體平均包封率為87.89﹪,平均粒徑為130.5nm,粒徑分布均勻.藥物溶解度明顯增加,體外穩(wěn)定性明顯增加.3. 大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)結(jié)果表明,姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體靜脈注射后消除半衰期為游離姜黃素Ⅲ注射液的1.22倍,AUC為1.95倍,清除率為0.5倍.提高注射濃度后,游離姜黃素Ⅲ因為溶解性差造成動物注射后即刻死亡明顯增加,而姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體在增加10倍

7、注射濃度后動物無一死亡,注射安全性顯著改善,且血藥濃度可明顯提高,AUC增加為13.58倍.4. 姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體和游離姜黃素Ⅲ均可對體外培養(yǎng)的A549細胞增殖活性產(chǎn)生明確影響(p<0.05),有劑量依賴性,其IC<,50>值分別為12.108ug·ml<'-1>和16.989ug·ml<'-1>.流式細胞儀檢測細胞周期主要被阻滯在S期.空白脂質(zhì)體與陰性對照比較差異不顯著(p>0.05).5. 姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體促進A549細胞死亡可能包含誘

8、導(dǎo)凋亡和促進壞死兩種方式,15ug·ml<'-1>濃度時出現(xiàn)明顯凋亡,20ug·ml<'-1>濃度以上則以壞死為主.6.RT-PCR結(jié)果表明姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體和游離姜黃素Ⅲ作用后,A549細胞抗凋亡基因bcl-2在mRNA水平的表達均受到抑制,有一定劑量依賴性.結(jié)論:1.選擇脂質(zhì)體作為姜黃素Ⅲ單體的藥物載體是可行的,包封率高,藥物溶解度和體外穩(wěn)定性明顯增加.2.脂質(zhì)體包裹姜黃素Ⅲ后,其靜脈注射安全性得到顯著改善,注射后血藥濃度及曲線下面積均

9、明顯增加.脂質(zhì)體劑型的制備有望解決姜黃色素不易靜脈給藥的難題,使實現(xiàn)姜黃素Ⅲ靜脈應(yīng)用并達到有效血藥濃度成為可行.3.制備的姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體對體外培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549的生物學(xué)特性有明確的影響,①可抑制細胞的惡性增殖,并阻滯細胞周期在S期,② 誘導(dǎo)細胞凋亡和促進細胞壞死.姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體的作用與陰性對照比較差異顯著,與游離姜黃素Ⅲ比較其抑制活性沒有減弱,表示其有可能在肺癌的治療中發(fā)揮作用.4.姜黃素Ⅲ脂質(zhì)體和游離姜黃素Ⅲ作用后均可抑制bcl