樹突狀細胞與肺癌細胞A549融合疫苗生物學特性研究.pdf

1、目的：制備樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)和肺癌細胞A549的融合疫苗，探究該融合疫苗的生物學特性，為今后DC/A549融合疫苗進一步的體內(nèi)研究和臨床應用提供實驗及理論基礎(chǔ)。
　　方法：1.樹突狀細胞與肺癌細胞A549融合細胞的制備。用密度梯度離心法從健康成人外周血分離單個核細胞，加入細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a誘導培養(yǎng)7-8天后所得細胞為成熟DC，流式細胞儀檢測細胞的免疫表型；用細胞膜紅

2、色熒光染料PKH-26標記肺癌細胞A549，用鼠抗人HLA-DR-FITC綠色熒光標記成熟DC，兩者按1：1比例混合，在50％聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)的誘導下制備融合細胞，流式細胞儀測定融合率，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察融合細胞；加入與誘導培養(yǎng)DC時相同濃度的細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4靜置培養(yǎng)，24h后棄去懸浮細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，4-5天后收集懸浮及半懸浮細胞即為篩選純化的融合細胞。2.

3、融合疫苗的生物學特性。體外培養(yǎng)DC/A549融合細胞并計數(shù)，描繪細胞的體外生長曲線，比較融合細胞與親代DC和肺癌A549細胞在體外的分裂增殖能力；用尼龍毛柱法分離外周血T淋巴細胞，MTT法檢測比較DC/A549融合疫苗、與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)的DC、單純培養(yǎng)的DC三者刺激T淋巴細胞的增殖能力；MTT法檢測比較DC/A549融合疫苗、與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)的DC以及未經(jīng)抗原致敏的DC分別誘導的細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic

4、 T lymphocytes，CTLs)體外殺傷肺癌細胞A549的細胞毒效應。
　　結(jié)果：1.人外周血單個核細胞經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α誘導分化7-8天后可獲得形態(tài)典型的DC，成熟DC高表達表面分子HLA-DR、CD80和CD83；50%PEG能夠較有效地誘導DC與肺癌細胞A549的融合，融合率為32.76%；融合細胞呈類圓形，體積較單個肺癌細胞或樹突狀細胞稍大。2.DC/A549融合疫苗體外生長曲線平緩，未見

5、明顯的細胞倍增期，與親代DC的體外生長曲線類似，而肺癌細胞A549體外增生活躍，其生長曲線未見明顯的平臺期。DC與肺癌細胞A549融合細胞組（DC/A549融合組）、DC與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)組（DC+A549混合組）和單純DC組均能刺激T淋巴細胞明顯增殖，與T淋巴細胞對照組相比有顯著性差異（P<0.05）；融合細胞組刺激T淋巴細胞的增殖能力明顯高于DC與A549混合培養(yǎng)組、單純DC組，差異有顯著性意義(P<0.05)；混合培養(yǎng)DC

6、組與單純DC組相比(P>0.05)，尚不能認為兩組刺激T細胞的增殖能力不同。DC/A549融合疫苗體外誘導的CTLs對肺癌細胞A549（靶細胞）的殺傷率為(75.48±5.06)％；DC與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)誘導的CTLs對靶細胞的殺傷率為(45.46±2.88)％；未經(jīng)抗原致敏的DC誘導的CTLs對靶細胞的殺傷率為(15.72±0.61)％；單純未被刺激的T淋巴細胞對靶細胞的殺傷率為(14.53±0.74)％。DC/A549融合疫

7、苗組誘導的CTLs對肺癌細胞A549的殺傷效應均顯著高于DC與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)組、未經(jīng)抗原致敏的DC組及單純T淋巴細胞組，差異有顯著性意義(P<0.05)；DC與肺癌細胞A549混合培養(yǎng)組誘導的CTLs對肺癌細胞A549的殺傷效應顯著高于未經(jīng)抗原致敏的DC組和單純T淋巴細胞組，差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.人外周血單核細胞在體外可誘導分化為具有典型形態(tài)和細胞表型的成熟DC。DC與肺癌細胞A549經(jīng)50%