幽門螺桿菌感應蛋白CrdS的原核表達及其在酸適應調控中的作用.pdf

1、目的:原核表達并純化幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdRS信號傳導系統(tǒng)中的感應蛋白CrdS，并進行生物信息學分析，通過體外酸環(huán)境培養(yǎng)實驗，探討其在H.pylori酸適應調控中的作用。
　　方法:提取H.pylori26695標準株全基因組DNA，以此為模版，PCR擴增編碼CrdS蛋白的基因hp1364;構建重組克隆質粒pUCm-T-hp1364和原核表達質粒pQE30-hp1364，經PC

2、R、雙酶切和測序鑒定后，轉化大腸埃希菌XL1blue，IPTG誘導表達目標蛋白;通過SDS-PAGE分析，Western blot鑒定表達蛋白，并對CrdS蛋白進行生物信息學分析。用純化后的重組蛋白CrdS免疫家兔獲得其免疫血清。通過體外在不同pH值的培養(yǎng)基中加入含抗CrdS的免疫血清培養(yǎng)H.pylori實驗，初步探討CrdS在H.pylori酸適應調控中的作用。
　　結果:以提取的H.pylori基因組DNA為模板，PCR擴增h

3、p1364基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見在1200bp處有一明顯條帶，與hp1364基因的分子量大小相符。重組克隆質粒pUCm-T-hp1364和原核表達質粒pQE30-hp1364經BamHⅠ/HindⅢ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析可見約1200bp處有明顯條帶;測序后，經NCBI BLAST在線比對所測序列與hp1364基因序列完全相符。誘導表達的目標蛋白經SDS-PAGE分析，相對分子量約為46kDa，主要以包涵體形式存

4、在。Western blot鑒定表明表達蛋白確為目標蛋白。生物信息學分析CrdS的核酸和氨基酸序列與其它H.pylori菌株比較具有極高的同源性，表面有許多親水性區(qū)域，含有多種容易被磷酸化的氨基酸。免疫家兔后獲得該重組蛋白的免疫血清，H.pylori酸環(huán)境培養(yǎng)實驗表明CrdS能夠影響H.pylori的生長。
　　結論:成功構建了重組克隆質粒pUCm-T-hp1364和原核表達質粒pQE30-hp1364，原核表達了H.pylori