動(dòng)脈粥樣硬化候選基因GALNT3在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、動(dòng)脈粥樣硬化候選基因GALNT3在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究
　　背景與目的:冠心病是由多種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致的復(fù)雜疾病，也是導(dǎo)致全球人口死亡的首位原因。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，各種理化因素導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase3，GALNT3)基因編碼ppG

2、alNAc-T3，是ppGalNAc-Ts家族成員，催化蛋白質(zhì)O-GalNAc糖基化，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要的生物學(xué)意義。目前還沒有關(guān)于GALNT3在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的報(bào)道。本研究在漢族人群中對(duì)GALNT3基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究。同時(shí)探討了GALNT3基因在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用單個(gè)位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析和Gene-based關(guān)聯(lián)分析的方法，

3、在1，515例冠心病病例和5，019例對(duì)照樣本中對(duì)GALNT3基因所在區(qū)域的13個(gè)SNPs進(jìn)行分析，相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析使用SAS、PLINK和R等軟件完成。
　　2.應(yīng)用real-time PCR方法在冠心病病例/對(duì)照（58例vs120例）的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）樣本中，檢測(cè)GALNT3mRNA水平。
　　3.采用基因敲低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的策略研究GALNT3

4、基因?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、凋亡以及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)表達(dá)水平的影響。利用AnaeroPack-Anaero厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣袋建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧培養(yǎng)模型，HUVECs缺氧條件下培養(yǎng)的同時(shí)過(guò)表達(dá)GALNT3基因，研究GALNT3基因?qū)θ毖踔聝?nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)real-timePC

5、R和Western Blot檢測(cè)GALNT3及其靶基因的mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.在加性模型下，校正性別、年齡后，位點(diǎn)rs13427924和rs4621175（不存在連鎖不平衡，r2＜0.2）與冠心病達(dá)到潛在的關(guān)聯(lián)（P值分別為0.008和0.03）;Gene-based關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示GALNT3基因與冠心病存在顯著關(guān)聯(lián)(P=0.011)。
　　2.冠心病病例/對(duì)照的PBMCs樣本中，冠心病組GALNT

6、3 mRNA水平下降為對(duì)照組的58.5％，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。
　　3.缺氧誘導(dǎo)HUVECs損傷模型中，GALNT3基因表達(dá)水平顯著下降(P＜0.001)。HUVECs中敲低GALNT3基因表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，使MMP-2和MMP-14在mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。過(guò)表達(dá)GALNT3基因顯著抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)，MMP-2和MMP-14在mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05);缺氧

7、培養(yǎng)條件下，過(guò)表達(dá)GALNT3基因抑制缺氧損傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制缺氧條件下的MMP-2和MMP-14的表達(dá)。信號(hào)通路分析結(jié)果顯示:敲低GALNT3的表達(dá)時(shí)，磷酸化p38水平顯著升高;GALNT3基因過(guò)表達(dá)時(shí)抑制磷酸化p38蛋白水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GALNT3基因過(guò)表達(dá)時(shí)，抑制缺氧誘導(dǎo)的p38/MAPK信號(hào)通路的激活。
　　結(jié)論:本研究首次揭示了GALNT3基因在冠心病中的作用。遺傳關(guān)聯(lián)分析顯示GALNT3基因單核苷酸多態(tài)性

8、與冠心病相關(guān)。冠心病患者PBMCs中GALNT3基因的表達(dá)水平顯著下降。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，下調(diào)的GALNT3基因通過(guò)調(diào)控p38/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)HUVECs的凋亡，促進(jìn)MMP-2和MMP-14在HUVECs中的表達(dá)水平，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　第二部分、高血壓易感位點(diǎn)rs820430調(diào)控鹽敏感性基因SLC4A7表達(dá)的機(jī)制研究
　　背景與目的:原發(fā)性高血壓是一種由遺傳與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，

9、具有高度的遺傳異質(zhì)性。近年來(lái)，應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與血壓或原發(fā)性高血壓相關(guān)的位點(diǎn)或區(qū)域。本課題組前期采用GWAS結(jié)合meta分析，發(fā)現(xiàn)了鄰近SLC4A7基因的rs820430位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群的高血壓風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但它通過(guò)何種途徑或方式調(diào)節(jié)高血壓風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)因素仍然未知。本論文對(duì)rs820430位點(diǎn)調(diào)控SLC4A7基因表達(dá)的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。大量流行病學(xué)研

10、究表明飲食中鈉的含量直接影響血壓的變化，本研究同時(shí)對(duì)包括SLC4A7基因在內(nèi)的SLC4家族中5個(gè)鈉離子偶聯(lián)的碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Na-coupled bicarbonate transports，NCBTs)基因常見變異與血壓對(duì)膳食鈉鹽的反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。
　　方法:
　　1.利用TaqMan探針?lè)z測(cè)274例健康個(gè)體rs820430位點(diǎn)的基因型，實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)其外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBM

11、Cs)樣本中SLC4A7基因mRNA水平，分析rs820430基因型與SLC4A7基因表達(dá)的關(guān)系;
　　2.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)rs820430等位基因特異性的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性，利用電泳遷移率變更實(shí)驗(yàn)(EMSA)、電泳超遷移率變更分析(supershift-EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)分別在體外和細(xì)胞內(nèi)篩選、鑒定等位基因特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;
　　3.利用來(lái)自“鹽敏感性研究遺傳流行病學(xué)協(xié)作網(wǎng)絡(luò)”(Gene

12、tic EpidemiologyNetwork of Salt Sensitivity，GenSalt)的共1906例研究對(duì)象。研究對(duì)象接受3天基線調(diào)查、7天低鹽膳食和7天高鹽膳食的膳食干預(yù)。5個(gè)NCBTs基因及其上下游5kb區(qū)域共76個(gè)SNPs納入分析。使用混合效應(yīng)模型，在加性模型、顯性模型、共顯性模型和隱性模型下分析SNP的基因型與低鹽和高鹽膳食干預(yù)下血壓反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)，對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，計(jì)算膳食干預(yù)后血壓反應(yīng)的平均效應(yīng)及95％可信區(qū)

13、間。相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析使用SAS和Hapoview軟件完成。
　　結(jié)果:
　　1.高血壓易感位點(diǎn)rs820430不同基因型影響SLC4A7基因的表達(dá)水平。與rs820430常見等位基因C的純合子(CC)個(gè)體相比，少見等位基因T純合子(TT)個(gè)體的SLC4A7 mRNA水平顯著升高(P=0.047);
　　2.報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，rs820430具有等位基因特異性的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子活性，T等位基因的轉(zhuǎn)錄活性是C等位基因的1.3倍;

14、EMSA結(jié)果顯示rs820430的T等位基因與核蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于C; supershift-EMSA鑒定出轉(zhuǎn)錄因子cFOS與rs820430位點(diǎn)的T等位基因特異結(jié)合;ChIP實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞內(nèi)水平證明cFOS與rs820430位點(diǎn)的T等位基因結(jié)合;
　　3.低鹽膳食干預(yù)階段，在加性模型下，SLC4A4基因的rs4254735位點(diǎn)與舒張壓(DBP)的低鹽反應(yīng)性相關(guān)，如與rs4254735 GG純合子個(gè)體相比，攜帶A等位基因的個(gè)體DBP（

15、-2.91 mmHg vs-0.40 mmHg，P=5.05×10-4）下降更加明顯;在共顯性和隱性模型下，SLC4A7基因的rs13077400位點(diǎn)與收縮壓(SBP)的低鹽反應(yīng)性相關(guān)，如在隱性模型下，與rs13077400 GG純合子個(gè)體相比，攜帶A等位基因的個(gè)體SBP（-5.50 mmHg vs-0.57 mmHg，P=1.15×10-6）下降更加明顯。在高鹽膳食干預(yù)階段，在加性模型、顯性模型和共顯性模型下，SLC4A4基因的rs1

16、0022637位點(diǎn)與SBP、DBP和平均動(dòng)脈壓(MAP)對(duì)高鹽干預(yù)的反應(yīng)性相關(guān)，隨著rs10022637位點(diǎn)少見等位基因C的增加，血壓對(duì)高鹽干預(yù)的反應(yīng)性下降，例如加性模型下，在rs10022637位點(diǎn)TT，CT和CC三種基因型個(gè)體血壓的變化效應(yīng)分別為SBP（4.62 mmHg vs5.94 mmHg vs6.00 mmHg，P=-1.14×10-4）;DBP(1.72 mmHg vs3.22 mmHg vs3.94 mmHg,P=2.2

17、6×10-5)和MAP(2.69 mmHg vs4.13 mmHg vs4.61 mmHg，P=2.07×10-6)，上述關(guān)聯(lián)關(guān)系在經(jīng)過(guò)Bonferroni多重校正之后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　本研究對(duì)前期高血壓GWAS發(fā)現(xiàn)的高血壓易感位點(diǎn)rs820430的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，明確rs820430不同基因型影響SLC4A7基因的表達(dá)水平。rs820430位點(diǎn)具有等位基因特異性轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子活性，風(fēng)險(xiǎn)等位基因T特異性