血管內(nèi)皮中SUMO化修飾在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、心血管疾病現(xiàn)已是全球范圍造成死亡的頭號(hào)原因。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，一種新型的蛋白翻譯后修飾SUMO化修飾與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。本研究從血管內(nèi)皮細(xì)胞激活釋放的一類警戒素分子“Alarmin”入手，探究SUMO化修飾對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)疾病的作用和機(jī)制，同時(shí)用遺傳多態(tài)性標(biāo)記的方法尋找與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的SUMO家族去SUMO化酶基因突變位點(diǎn)，為人類心血管疾病的干預(yù)治療提供新的理論基礎(chǔ)以及新策

2、略。我們首先采集了大量臨床動(dòng)脈粥樣硬化疾病患者和健康人群血液樣本，通過ELISA驗(yàn)證其血漿Alarmin分子（IL-lα、IL-18、IL-33、HMGB1）水平差別，結(jié)果表明As小于50％的患者血漿Alarmins平均濃度最高，且差異顯著（P值均小于0.05）。依據(jù)臨床證據(jù)，我們?cè)隗w外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞并在24h以內(nèi)對(duì)其施加H2O2、TNF-α、IFN-γ處理來模擬臨床病理狀態(tài)。通過qRT-PCR、Western Blot、ELISA的

3、一系列檢測，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)刺激后的細(xì)胞SUMO家族蛋白和Alarmin分子在mRNA水平均無顯著變化（P值均大于0.05），而SUMO化修飾水平與胞外Alarmin濃度同時(shí)上調(diào)并在某一時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大值（除個(gè)別外，P值均小于0.05，差異顯著），由此也驗(yàn)證了SUMO直接連接靶蛋白修飾和Alarmin分子前體經(jīng)加工釋放的作用機(jī)制。隨后我們發(fā)現(xiàn)，在SUMO化分子SUMO1、SUMO2和SUMO化E2酶UBC9基因敲低的細(xì)胞中Alarmin分子的表

4、達(dá)明顯受到抑制，細(xì)胞內(nèi)外含量（包括起始表達(dá)量）均低于正常細(xì)胞，且差異顯著（除個(gè)別外，P值均小于0.05）;而在去SUMO化酶SENP1基因敲低的細(xì)胞中結(jié)論正好相反，但無顯著差異(P＞0.05)，這證明了SUMO修飾與Alarmin分子表達(dá)的正相關(guān)性。進(jìn)一步我們檢測了介導(dǎo)Alarmin釋放的體炎癥小體的主要蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1，發(fā)現(xiàn)NLRP3、ASC的表達(dá)量并不隨病理?xiàng)l件刺激而改變，二者直接結(jié)合造成高濃度Caspas

5、e-1前體并將其剪切加工成熟，從而促進(jìn)Alarmin分子釋放。
　　另外，我們采用DNA一代測序技術(shù)，以臨床As患者及健康人群血液樣本為實(shí)驗(yàn)材料，通過與數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，篩查出3個(gè)SENP1雜合突變位點(diǎn)c.220G＞T、c.504T＞C(rs886588)、c.1211A＞G，其中c.220G＞T與c.1211A＞G并非已報(bào)導(dǎo)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)，且c.220

6、G＞T突變頻率(f=0.30）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)初步證明了3個(gè)突變均造成SENP1半衰期不同程度的縮短，并使其定位至細(xì)胞質(zhì)中，以上3個(gè)突變的疊加效應(yīng)更強(qiáng);但任一突變對(duì)SENP1蛋白酶活均無顯著影響。
　　綜上所述，SUMO化修飾對(duì)Alarmin分子的表達(dá)與釋放起正調(diào)控作用，且SENP1突變位點(diǎn)c.220G＞T、c.504T＞C、c.1211A＞G改變了其蛋白穩(wěn)定性與定位。但SUMO調(diào)控Alarmin分子的具體機(jī)制、SENP1突變