體外不同動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞整合素α-,5-、α-,6-、β-,1-表達(dá)和細(xì)胞增殖、功能活性的影響的初步研究.pdf

1、在生理狀況下的咀嚼運(yùn)動(dòng)或是咬合創(chuàng)傷期、正畸治療或是各種修復(fù)體行使功能時(shí)，不同的機(jī)械力作用于牙體并傳遞到牙周組織，引起包括牙周膜和牙槽骨在內(nèi)的牙周組織的改建。牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontalligamentfibroblast，PDLF)作為牙周膜中的主要感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞，對(duì)牙周組織的改建起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其增殖活性和功能狀態(tài)的改變也直接反映了牙周組織改建的狀態(tài)。因此，深入研究PDLF在機(jī)械應(yīng)力作用下的生物應(yīng)答及應(yīng)答機(jī)制是

2、十分必要的。 目的： 本課題旨在通過(guò)四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞(humanperiodontalligamentfibroblast，HPDLF)進(jìn)行加載，比較全面地探討了HPDLF在不同作用方式、不同大小和不同作用時(shí)間的動(dòng)態(tài)力學(xué)微應(yīng)變范圍內(nèi)細(xì)胞增殖、功能活性及細(xì)胞膜表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的變化。研究動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變作用下HPDLF的生物學(xué)行為的改變，并初步探討機(jī)械應(yīng)力與整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)的關(guān)系。 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文方法：1.采用刮取剛拔除的牙齒牙根中1/3部位的牙周膜組織的方法進(jìn)行取材，采用Ⅰ型膠原酶消化+組織塊貼附的方法培養(yǎng)原代細(xì)胞并傳代，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行來(lái)源鑒定和堿性磷酸酶(alkalinephosogatase，ALP)染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。為細(xì)胞力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。 2.將體外培養(yǎng)的HPDLF接種在特制的細(xì)胞培養(yǎng)板上，采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載裝置對(duì)其進(jìn)行加

4、載，頻率為0.5Hz，應(yīng)變幅度分別為1000、2000、4000μstrain的動(dòng)態(tài)力學(xué)微應(yīng)變(即分別相當(dāng)于0.1、0.2、0.4％的細(xì)胞變形)，加載時(shí)間選取的是12hr內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)分析細(xì)胞周期的改變，比較全面地探討不同作用方式、大小和時(shí)間的動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。 3.采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLF進(jìn)行加載，通過(guò)定量分析的方法，比較全面地探討

5、不同作用方式、大小和時(shí)間的動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變對(duì)細(xì)胞總蛋白含量和ALP活性的影響。 4.采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLF進(jìn)行加載，通過(guò)FCM分析不同動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變對(duì)HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的影響，初步探討機(jī)械應(yīng)力與整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)獲得了典型的、具有穩(wěn)定增殖特性的HPDLF，適于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)。 2.本實(shí)驗(yàn)加載裝置所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)力學(xué)微應(yīng)變范圍

6、對(duì)HPDLF的G0/G1期、S期細(xì)胞百分比和增殖指數(shù)PI產(chǎn)生明顯的影響，其中G0/G1期細(xì)胞百分比的減少、S期細(xì)胞百分比和PI的增加，提示細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖活性增加；而且此影響與應(yīng)變的作用方式、應(yīng)變大小、-5-四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文作用時(shí)司密切相關(guān)。 3.本實(shí)驗(yàn)加載裝置所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)力學(xué)微應(yīng)變范圍引起了HPDLF總蛋白含量及ALP活性的增高，而且此影響與應(yīng)變的作用方式、應(yīng)變大小、作用時(shí)間密切相關(guān)；總蛋白含

7、量及ALP活性總蛋白含量及ALP活性的變化趨勢(shì)并不完全相同。 4.本實(shí)驗(yàn)證明了未加力條件下體外培養(yǎng)的HPDLF膜表面同時(shí)有整合素α5、α6、β1亞單位的表達(dá)；而且β1的表達(dá)量最高，α5次之，α6較低。動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變引起了HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的上調(diào)，此影響與應(yīng)變的大小和作用時(shí)間密切相關(guān)；在不同亞單位間存在一定的相關(guān)性和差異性。 結(jié)論： 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的上述結(jié)果可以推測(cè)，動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變引起的HPDLF膜

8、表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的變化，與細(xì)胞增殖、合成功能的變化及細(xì)胞分化密切相關(guān)。整合素表達(dá)的變化早于細(xì)胞增殖和功能活性的變化，是一個(gè)較早期的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，提示它們之間可能存在著一定的因果關(guān)系。在適宜大小和作用時(shí)間的動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變下，隨著細(xì)胞膜表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的上調(diào)，可能通過(guò)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、凋亡以及細(xì)胞因子生成等細(xì)胞的生理機(jī)能，從而表現(xiàn)出細(xì)胞增殖活性和合成功能的增加、促進(jìn)細(xì)胞分化。當(dāng)然細(xì)胞內(nèi)

9、還存在其他多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞生理機(jī)能的調(diào)控。結(jié)果提示，整合素β1亞族可能在HPDLF的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖、功能活性方面具有重要的調(diào)控作用。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)加載裝置所采用的頻率為0.5Hz，應(yīng)變幅度為1000、2000、4000μstrain的動(dòng)態(tài)力學(xué)微應(yīng)變范圍內(nèi)(即分別相當(dāng)于0.1、0.2、0.4％的細(xì)胞變形)，適宜大小和作用時(shí)間的力學(xué)應(yīng)變-6-四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文既能引起體外培養(yǎng)的HPDLF

10、膜表面整合素α5、α6、β1表達(dá)的上調(diào)，細(xì)胞增殖活性和合成功能增加、促進(jìn)細(xì)胞分化。結(jié)果提示，在體內(nèi)生理狀況下的咀嚼運(yùn)動(dòng)和修復(fù)體正常行使功能(即非咬合創(chuàng)傷和正畸加力)，牙周組織受到適宜的機(jī)械性應(yīng)力作用時(shí)，HPDLF作為牙周膜中的主要感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞，對(duì)包括牙槽骨在內(nèi)的牙周組織的改建起著關(guān)鍵的調(diào)控作用；其增殖活性和功能狀態(tài)的良性改變也直接反映了牙周組織改建的良性狀態(tài)。 但應(yīng)當(dāng)注意的是，體外模擬HPDLF加力的實(shí)驗(yàn)研究由于所用的

11、實(shí)驗(yàn)加載裝置的不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)應(yīng)力方式、應(yīng)力大小、應(yīng)力變化頻率和作用時(shí)間的不同而有所差異。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的相關(guān)性，但并不具備可比性。此外，體外模擬HPDLF加力的實(shí)驗(yàn)研究受到一定的局限，不能完全模擬體內(nèi)的受力環(huán)境；同時(shí)離體狀態(tài)的細(xì)胞由于沒(méi)有組織結(jié)構(gòu)的制約，其生物學(xué)行為的響應(yīng)與群體細(xì)胞組織化的整體行為響應(yīng)具有較大的差異性。因此，在分析體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果時(shí)，不能簡(jiǎn)單地套用到體內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅在一定程度上從細(xì)胞水平和