低強(qiáng)度脈沖超聲波促人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)表達(dá)的初步研究.pdf

1、牙周病、不當(dāng)口腔臨床治療、外傷等均可造成牙周組織損傷、破壞。隨著口腔保健意識(shí)及功能、美觀等要求的提高,患者希望盡可能保留牙齒。因此,獲得牙周組織的再生性修復(fù)十分必要,其生物學(xué)基礎(chǔ)依賴于牙周膜細(xì)胞(PDLCs)的有效增殖。牙周膜(PDL)是牙根與牙槽骨之間的一薄層結(jié)締組織,由處于不同增殖階段或具不定向分化趨勢(shì)的多細(xì)胞亞群構(gòu)成,在外界刺激下可定向增殖、分化,從而實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生性修復(fù)。成纖維細(xì)胞是人牙周膜細(xì)胞(HPDLCs)的優(yōu)勢(shì)亞群之一

2、,具有較強(qiáng)的增殖能力、多向分化潛能等干細(xì)胞的某些特性,在牙周組織的再生性修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。以往研究多探討細(xì)胞因子、中藥、物理、化學(xué)物質(zhì)陽(yáng)等因素作用下人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLF)增殖、分化的改變及其機(jī)理,以期達(dá)到對(duì)其定向調(diào)控并促進(jìn)牙周組織再生。但尚未發(fā)現(xiàn)一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的促進(jìn)HPDLF增殖效應(yīng)表達(dá)的途徑。近年來,低強(qiáng)度脈沖超聲波(LIPUS)在無創(chuàng)促進(jìn)骨創(chuàng)傷修復(fù)的作用已得到臨床認(rèn)可和應(yīng)用；亦有研究發(fā)現(xiàn)其生物、物理學(xué)效應(yīng)可促進(jìn)某

3、些細(xì)胞的增殖、分化。因此,LIPUS對(duì)HPDLF增殖效應(yīng)表達(dá)的影響具有極高研究?jī)r(jià)值和潛在應(yīng)用前景。
　　 本研究采用組織塊法培養(yǎng)了HPDLCs,并進(jìn)一步純化構(gòu)建了HPDLF的體外純化培養(yǎng)模型。在該模型基礎(chǔ)的細(xì)胞組織學(xué)來源鑒定證實(shí)其為中胚層來源；采用MTT法繪制了不同接種密度(1*104、2*104、1*103)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)HPDLF的適宜接種密為1*104度；結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)趨勢(shì)觀察等證實(shí)本研究構(gòu)建的HPDLF體外培養(yǎng)

4、系性狀穩(wěn)定、活性良好。在前述成果基礎(chǔ)上,構(gòu)建了“HPDLF-LIPUS輻照模型”,經(jīng)MTT法、考馬斯亮藍(lán)(coomassie brilliant blue,CBB)染色法等定量、半定量檢測(cè)方法比較了不同參數(shù)(聲強(qiáng):30MW、60MW、90MW,作用時(shí)間:10min、20min、30min,重復(fù)頻率1KHz,脈沖頻率1.5MHz)的LIPUS輻照對(duì)HPDLF的增殖活性、胞內(nèi)總蛋白表達(dá)量的影響,初步探討了LIPUS輻照對(duì)HPDLF增殖效應(yīng)表

5、達(dá)的影響。遴選適宜本實(shí)驗(yàn)條件下促進(jìn)HPDLF增殖效應(yīng)表達(dá)的LIPUS輻照參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的LIPUS輻照模型具有操作簡(jiǎn)便,成本低、可有效控制細(xì)胞污染等優(yōu)勢(shì),并保證了超聲輻照的穩(wěn)定性、有效性。MTT生長(zhǎng)曲線及CBB蛋白測(cè)定結(jié)果均顯示LIPUS輻照對(duì)HPDLF的增殖效應(yīng)表達(dá)有促進(jìn)效應(yīng),且90mw,20min/天(重復(fù)頻率1 KHz,脈沖頻率1.5MHz)的輻照參數(shù)效應(yīng)最顯著。但最長(zhǎng)輻照時(shí)間(30min)組和最大聲強(qiáng)組(90mw)中均未

6、發(fā)現(xiàn)抑制效應(yīng),并且90mw,20min/天輻照下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和蛋白濃度變化發(fā)現(xiàn)具有近似變化趨勢(shì),表明LIPUS對(duì)HPDLF的促增殖效應(yīng)不僅是細(xì)胞數(shù)量增加的促分裂效應(yīng),也同時(shí)提高細(xì)胞的功能活性。這提示采用LIPUS輻照法有助于獲得具有較高功能活性的HPDLF種子細(xì)胞。基于前述最適宜參數(shù),本研究進(jìn)一步結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR法檢測(cè)了LIPUS輻照下HPDLF的細(xì)胞周期及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Fact

7、or,bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)的表達(dá)水平。本研究顯示受LIPUS輻照6h、12h時(shí),HPDLF均顯著表達(dá)bFGF,且12h表達(dá)量高于6h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),推測(cè)HPDLF在受LIPUS輻照后12h內(nèi)對(duì)bFGF的表達(dá)有隨時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)的趨勢(shì)。但是,尚未見TGF-β1的顯著表達(dá),可能系HPDLF受LIPUS輻照12h內(nèi)所表達(dá)細(xì)胞因子如bFGF等間接

8、抑制了其對(duì)TGF-β1的表達(dá),或TGF-β1的表達(dá)發(fā)生在HPDLF受LIPUS輻照12h后。此外,細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示LIPUS輻照后HPDLF的增殖指數(shù)(proliferation index,PrI)較對(duì)照組顯著提高,具有與對(duì)照組一致的周期性波動(dòng)。這可能與HPDLF固有細(xì)胞周期循環(huán)相關(guān),提示LIPUS對(duì)HPDLF促增殖效應(yīng)表達(dá)的機(jī)制之一為提高HPDLF的PrI,但不能通過改變HPDLF固有細(xì)胞周期時(shí)間的方式加快細(xì)胞增殖速度。

9、　　 綜上所述,LIPUS輻照可促進(jìn)HPDLF的增殖效應(yīng)表達(dá),且基于本研究構(gòu)建“HPDLF-LIPUS輻照模型”的較適宜輻照參數(shù)為聲強(qiáng)90MW,輻照時(shí)間20min/d,重復(fù)頻率1KHz,脈沖頻率1.5MHz。本研究證實(shí)LIPUS輻照可提高HPDLF的PrI,從而促進(jìn)其增殖效應(yīng)的表達(dá),但不能改變其固有細(xì)胞周期時(shí)間。同時(shí),發(fā)現(xiàn)LIPUS輻照可促進(jìn)HPDLF對(duì)特定細(xì)胞因子的表達(dá)。上述結(jié)果提示90mW,20min/天的LIPUS輻照有助于獲得